Прислать материал
ИЗУЧЕНИЕ АБСОРБЦИОННЫХ СВОЙСТВ ГИАЛУРОНИДАЗЫ, ИММОБИЛИЗИРОВАННОЙ НА РАЗЛИЧНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ
Большинство лекарственных препаратов белковой природы в клинической практике применяются преимущественно парентерально в виду их низкой биодоступности при энтеральном приеме. Такими препаратами, например, являются гиалуронат-эндо-β-N-ацетилгексозаминидаза (Г), ее фармакологические свойства хорошо изучены. В настоящий момент лекарственные препараты Г широко представлены на рынке, и все они имеют инъекционный способ введения. Наряду с выраженными положительными свойствами они обладают рядом нежелательных побочных эффектов. Для их устранения эффективно использовать модификации биологически активных веществ путем их соединения с низкомолекулярными носителями.
У крыс Wistar под наркозом вырезали фрагменты тощей кишки. С двух сторон фрагмента добавляли по 6 мл буфера Кребса-Рингера, pH 7,4. После 15-минутной преинкубации добавляли меченные FITC препараты (нативной и пегилированной гиалуронидазы, а так же модифицированной L31) до конечной концентрации 10 мкг/мл. Инкубация длилась в течение 10, 20 и 30 мин. После инкубации собирались полученные растворы, определялась их флуоресценция. Затем для изучения механизмов всасывания использовались специфические ингибиторы: колхицин и пониженная температура (4оС), полученная в данных условиях концентрация препаратов измерялась и сравнивалась. После проводилось исследование с помощью конфокальной микроскопии.
В процессе эксперимента по всасыванию препаратов на основе Г получено, что всасывание нативной Г происходит уже к 10 мин, а с 20 мин уже выходит на плато своего содержания (рис. 1). Подобная тенденция характерна и для пегилированной Г, но итоговая концентрация Г в 2 раза превышает содержание нативной Г. Для Г с полоксамером L31, характерно достижение максимального количества уже к 10 мин эксперимента при этом оно превышает максимальное всасывание по нативной Г в 3 раза. Для всех препаратов наблюдается характерная особенность - возникновения плато по концентрации абсорбированных препаратов на основе Г.
Для установления механизмов, участвующих во всасывании, использовали описанные ранее ингибиторы АТФ-зависимого пути. Определено, что после воздействия ингибиторов концентрации всосавшихся препаратов в тощей кишке (через 30 мин) составила минимальные пороговые значения по сравнению с данными при отсутствии ингибиторов (рис. 2). При инкубации при 4 С процесс всасывания может осуществляться только по пассивному пути, поскольку концентрация абсорбированных препаратов наоборот снижается, то мы полностью исключаем простые пассивные механизмы всасывания (осмос, диффузию) и большая молекулярная масса белка Г не позволила бы пройти по этому пути.
При предварительном 30-минутном инкубировании ткани с колхицином с последующей в течение 30 мин инкубацией при 37 С с растворами Г также получено полное ингибирование механизмов всасывания. Следовательно, в процессе абсорбции задействованы белки-переносчики или работа цитоскелета.
Из полученных результатов мы можем отследить несколько типичных характерных черт облегченной диффузии – высокая скорость переноса веществ, насыщаемость. При облегченной диффузии вещества переносятся через мембрану также по градиенту концентрации, но с помощью специальных трансмембранных белков переносчиков (транслоказ). Белок-переносчик имеет центр связывания, комплиментарный переносимому веществу, для этого процесса всасывания характерна высокая избирательность. Наличие транслоказ при абсорбции препаратов на основе Г, так же согласуется с нашими данными при использовании ингибиторов всасывания (низкой температуры и колхицина).
Снимки, полученные с помощью конфокальной микроскопии, позволяют получить представление о степени и особенностях абсорбции препарата. На снимках хорошо различима внутренняя строма ворсин, светящаяся в красном диапазоне, что подтверждает жизнеспособность и целостность лимфатических и капиллярных сосудов, тканей кишки в процессе операции. Слабая автофлуорисценция отмечается по всей длине ворсин слизистой оболочки в зеленом и красном спектре. При инкубации нативной Г., меченной FITC, на конфокальных снимках видна фрагментарная адсорбция лишь на апикальном полюсе кишечных ворсин, в то время как пегилированная и модифицированная на L31 Г и более активно адсорбируется на кишечных ворсинах.