Регистрация / Вход
Прислать материал

Получение и характеристика новых антикоагулянтов растительного происхождения

Сведения об участнике
ФИО
Ромаданова Мария Андреевна
Вуз
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Фармакология и фармацевтика
Тема
Получение и характеристика новых антикоагулянтов растительного происхождения
Резюме
Из растительных источников (Vaccinium myrtillus (Черника обыкновенная) и Antennaria dioica (Кошачья лапка двудомная)) выделены соединения, обладающие антикоагулянтной активностью. Определена их химическая природа и характер влияния на плазмокоагуляцию. Установлено, что антикоагулянтное действие эффекторов проявляется как в in vitro тестах, так и сохраняется при введении лабораторным животным.
Ключевые слова
гемостаз, плазмокоагуляция, природные антикоагулянты, растительные пептиды
Цели и задачи
Цель:
Выделить из растений Vaccinium myrtillus (Черника обыкновенная) и Antennaria dioica (Кошачья лапка двудомная) компоненты, обладающие антикоагулянтной активностью, охарактеризовать их химическую природу и механизм влияния на плазмокоагуляцию.
Задачи:
1) получить из растений экстракты, содержащие антикоагулянты;
2) провести очистку эффекторов;
3) охарактеризовать влияние активных компонентов на плазмокоагуляцию;
4) определить химическую принадлежность антикоагулянтов;
5) сравнить эффекторы из Antennaria dioica и из Vaccinium myrtillus.
Введение

Исследования, направленные на получение антикоагулянтов, начатые в первой половине 20 века, не прекращаются и в настоящее время. Такой интерес к поиску противосвертывающих средств обусловлен высокой долей клинических осложнений и фатальных событий, в основе которых лежит активация гемостаза.

Выполненные на кафедрах ТюмГМУ исследования растений, показали наличие антикоагулянтов в более чем 200 объектах флоры. Обнаружено, что компоненты экстрактов различных растений могут угнетать как заключительный этап свертывания крови, так и более ранние этапы активации коагуляционного каскада. Однако ранее не проводилась очистка большей части антикоагулянтов, их химическая идентификация и тестирование активности in vivo. 

Методы и материалы

Сухое измельченное растительное сырье подвергали двукратной экстракции, полученные экстракты отфильтровывали, концентрировали, отдиализовывали, недиализуемую часть высушивали, полученные сухие экстракты использовали для дальнейших исследований.

Для оценки антикоагулянтной активности готовили растворы экстрактов в буфере и в пулированной плазме крови определяли активированное частичное тромбопластиновое время, протромбиновое время и тромбиновое время в сравнении с контролем. Исследования проводили на автоматическом коагулометре, с использованием стандартных тест-систем, расчитывая эффективность торможения свертывания (i=1-tк/tо ,  где t- время свертывания в контроле и опыте).

Тестирование in vivo проводили, вводя растворы антикоагулянтов в изотоническом хлориде натрия самцам белых крыс, и оценивая активность свертывания крови в течение 2 часов, в сравнении с контролем.

Оценку чистоты экстрагируемых веществ проводили с помощью тонкослойной и гель-проникающей хроматографии, ставя аналитические реакции с выделенными компонентами. Природу антикоагулянтов устанавливали, гидролизуя очищенный эффектор и идентифицируя компоненты гидролизата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Статистический анализ полученных данных выполняли методами вариационной статистики для малых рядов наблюдений. Статистическую значимость оценивали, используя U-критерий Манна-Уитни, значимыми считались отличия при значениях р<0,05.

Описание и обсуждение результатов

Полученные суммарные экстракты обладает антикоагулянтной активностью, что выражается в удлинении времени, затрачиваемого на образование фибринового сгустка. Так, АЧТВ в присутствии раствора экстракта черники с конечной концентрацией 1 мг/мл удлинялось примерно на 25% (эффективность торможения i 0,15) , ПВ и ТВ при этом не изменялись. Экстракт кошачьей лапки в аналогичной концентрации выраженно тормозил АЧТВ (i 0,44) При разведении экстракта буфером наблюдали кратное снижение эффективности торможения фибринообразования.

Поскольку полученные экстракты являются смесью соединений, провели их разделение гель-проникающей хроматографией. Удалось разделить экстракт черники на 6 фракций, а экстракт кошачьей лапки на 9 фракций. Антикоагулянтную активностью сохраняла фракция 1 экстракта черники (наиболее активно тормозит АЧТВ), и фракция 1 экстракта кошачьей лапки (выраженно тормозит АЧТВ, менее выраженно – ПВ и ТВ).

Активные фракции экстрактов при введении лабораторным животным выраженно подавляли свертыванием крови, а их действие сохранялось не менее 2-х часов. При этом, активность антикоагулянта полученного из черники на протяжении времени наблюдения фактически не снижалась (i 0,18 по АЧТВ), а активность антикоагулянта из кошачьей лапки равномерно снижалась (с i 0,8 через 5 мин после введения, до i 0,3 по АЧТВ через 2 часа). Явного токсического действия ни один из экстрактов не проявлял.

Компоненты фракционированных экстрактов разделяли тонкослойной хроматографией, идентифицировав фенольные соединения и нингидрин-положительные вещества.Поскольку ранее было показано наличие в растительных тканях пептидных антикоагулянтов, а положительную реакцию с нингидрином могут давать многие соединения, для подтверждения пептидной природы эффекторов провели ферментативный гидролиз активных фракций. После обработки фракции 1 экстракта кошачьей лапки протеазой, убыль антикоагулянтной активности в сравнении с контрольными образцами составила 14,8% для АЧТВ, 21,9% для ПВ и 16,02% для ТВ. Аналогичная обработка фракции 1 экстракта черники привела к почти двукратной (на 47%) потере активности в отношении АЧТВ.

При кислотном гидролизе активных фракций с последующим разделением ТСХ обнаружен ряд нингидрин-положительных соединений (6 для кошачьей лапки и 5 для черники), совпадающих по величине удерживания с аминокислотами. При ВЭЖХ продуктов гидролиза экстракта кошачьей лапки идентифицированы аспарагиновая кислота, цистеин, треонин и валин, а в гидролизате экстракта черники – аспарагиновая и глутаминовая кислоты, цистеин и серин.

Таким образом, исследованные растения содержат соединения пептидной природы, обладающие антикоагулянтной активностью. Эффекторы сохраняют свою активность in vivo. Аминокислотный состав растительных эффекторов не идентичен, что объясняет различие во влиянии на плазмокоагуляцию.

Используемые источники
1. Дементьева И.А. Защитное действие недиализующейся фракции экстракта медуницы при угрозе тромбоза // Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень, 1992. - С. 30.
2. Русакова О.А. Растения флоры Сибири, как источники антикоагулянтов прямого действия // В сб.: Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень, 1992. - С. 84.
3. Калинин Е.П., Покацкий Д.А., Ромаданова М.А. Влияние антикоагулянта из черники обыкновенной на гемостаз // Микроциркуляция и гемореология (клиника и эксперимент: из лаборатории к постели больного) материалы международной научной конференции. – Ярославль, 2015, с. 140
4. Chandrasekar S. , Loomba R. , Shah P. , Arora R. The need for novel anticoagulation therapy in acute coronary syndrome // Am. J. Ther. 2013, Jan. Vol. 20 (1). P. 61-6. doi: 10.1097/ MJT. 0b013e31820543a3/PMID :21317627
Information about the project
Surname Name
Romadanova Mariya Andreevna
Project title
Preparation and characteristic of new plant-derived anticoagulants
Summary of the project
Compounds with anticoagulant activity have been prepared from the plants (Vaccinium myrtillus and Antennaria dioica) and their chemical nature and the character of influence on blood coagulation have been defined. It is established that the anticoagulant action of the effectors is detected in vitro and during the entering them into the experimental animals
Keywords
blood coagulation, anticoagulants, plant peptides