Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка тест-системы для диагностики фитопатогенов рода Pythium

Сведения об участнике
ФИО
Талых Дарья Андреевна
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова"
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Агро-, био- и производственные технологии
Раздел области наук
Земледелие и растениеводство
Тема
Разработка тест-системы для диагностики фитопатогенов рода Pythium
Резюме
В данном исследовании была создана ПЦР тест-система, состоящая из двух пар праймеров для двух генетических маркеров, позволяющая по длине ампликонов выявить наличие или отсутствие представителей рода питиум (Pythium) в пробах воды, почвы или тканей растений.
Ключевые слова
питиум, тест-система, диагностика, ПЦР, питиоз, корнеед, корневая гниль, заражение
Цели и задачи
Цель работы: разработка молекулярно-генетической тест-системы для диагностики фитопатогенов рода Pythium.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать методы экстракции ДНК питиума из растительных тканей, почвы, гидропоники, воды и других образцов.
2. Выявить группы молекулярно-генетических маркеров, пригодных для идентификации грибов рода питиума.
3. Изучить молекулярно-генетический полиморфизм по выбранным маркерам рода питиум и других близких организмов.
4. Провести дизайн праймеров (олигонуклеотидов) для молекулярно-генетической диагностики патогенов рода питиум.
5. Провести апробацию разработанных тест-систем, изучить специфичность и эффективность тест-систем.
6. Оптимизировать параметры тест-систем.
Введение

Настоящее исследование посвящено созданию тест-системы для диагностики и идентификации фитопатогенов рода питиум (Pythium Pringsheim, 1858) в растительных пробах, а также в пробах воды и почвы. Род питиум включает виды, вызывающие ряд заболеваний (корневая гниль сеянцев и взрослых растений, питиоз, выпревание сеянцев, черная ножка) многих сортов культурных растений.

Методы диагностики фитопатогенов, называемые традиционными, очень трудоемки, не всегда эффективны и часто дают некорректные результаты. Тем самым, возникает необходимость в создании более эффективных методов диагностики. Одним из таких методов является метод создания тест-систем на основе проведения полимеразной цепной реакции.

Методы и материалы

Материалы исследования

Материалом для исследования послужили образцы искусственного грунта, тканей огурцов и томатов, а также смывы, полученные из тепличного хозяйства АО «Тепличное» и потенциально пораженные патогенами рода питиум. 

Метод выделения ДНК

Выделение ДНК проводили с помощью наборов Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit и Bioline. Экстракцию ДНК проводили согласно инструкции производителя с небольшими модификациями. В качестве оптимизации этого протокола было увеличено время инкубации в литическом растворе до 1 суток, добавлено 60 µL Proteinase K Solution, а после добавления 400 µL 50% этанола, добавляли  200 µL фосфатно-солевого буфера (PBS), после чего проводили центрифугирование в течение 5 мин и при 14000 об./мин.

Метод постановки полимеразной цепной реакции

Полимеразная цепная реакция – экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК/РНК) в биологическом материале.

Метод детекции ДНК (горизонтального гель-электрофореза)

Электрофорез – это метод детекции ДНК, при котором молекулы разделяются в агарозном геле на основе их подвижности под действием электрического тока. ДНК имеет в совокупности отрицательный заряд, поэтому будет двигаться к аноду.

Метод выделения ДНК из геля

Проводился с помощью коммерческого набора Thermo Scientific по стандартному протоколу.

Описание и обсуждение результатов

Для анализа были взяты виды питиума, паразитирующие на важных сельскохозяйственных культурах. 

Подбор молекулярных маркеров и дизайн праймеров

Для создания тест-системы использовались два молекулярных маркера. Первый – фрагмент, кодирующий первую субъединицу цитохром-с-оксидазы (COI). Второй – транскрибируемый некодирующий спейсер ядерной ДНК (ITS), который находится между генами, кодирующими субъединицы рибосом.Для каждого молекулярного маркеры была подобрана пара праймеров.

Благодаря анализу Интернет-ресурса BLAST, было установлено, что подобранные праймеры специфичны для рода питиум, и данные пары праймеров могут использоваться для создания тест-системы. При проведении реакции по обоим маркерам, можно по длине ампликонов определить специфичность проведенной реакции. То есть одновременное наличие при детекции результатов ПЦР методом горизонтального гель-электрофореза двух полос (в COI – длиной 187 пар нуклеотидов, в ITS – длиной около 600 пар нуклеотидов) является показателем наличия в пробе представителя рода питиум.

Апробация и верификация тест-системы

Для апробации праймеров было взято 10 проб, по каждой из них была поставлена ПЦР на оба молекулярных маркера с градиентом температур отжига праймеров от 54,3оС до 61,9оС.

В результате обнаруживается большое количество фрагментов нужной длины в реакции на каждый молекулярный маркер в четырех пробах. Следовательно, можно утверждать о работоспособности нашей системы. При максимальных температурах в этой реакции по маркеру COI наблюдается почти полное отсутствие неспецифичных фрагментов, а по ITS неспецифичные продукты амплификации присутствуют при всех взятых в этой реакции температурах.

Оптимизация тест-системы

Протокол ПЦР по маркеру ITS был оптимизирован с целью уменьшения количества неспецифичных продуктов. Для этого были выбраны 2 пробы. Одна проба представляет собой искусственный грунт и корень вялого растения, а вторая – смыв с искусственного грунта томата. Проведение ПЦР по ней позволит оценить чувствительность тест-системы. По этим двум пробам по маркеру ITS была поставлена градиентная ПЦР с четырьмя градиентами температуры отжига праймеров – от 57,1оС до 63,7оС.

В результате проведения реакции прослеживается тенденция к уменьшению неспецифичных фрагментов с увеличением температуры. Таким образом, оптимальной температурой для работы данной тест-системы по макеру ITS является значение 63,7оС, а по региону COI оптимальное значение температуры отжига праймеров – 60,0оС. Результат по пробе из смыва с искусственного грунта томата показывает высокую чувствительность тест-системы, ввиду небольшого количества ДНК в смыве с искусственного грунта.

Используемые источники
1. Переведенцева Л.Г. Микология. Грибы и грибоподобные организмы, 2012.
2. Пыстина К.А. Род Pythium Pringsh. Вып. 2 Определитель грибов России: Класс Оомицеты, 1976.
3. Garwe D. et al. Molecular Characterization of Pythium Species Affecting Tobacco in the Float Tray Seedling Production System, 2014.
4. Klemsdal S.S. et al. PCR-based identification of Pythium spp. causing spot in carrots and sensitive detection in soil samples, 2008.
5. Li M. et al. Development of real-time PCR technique for the estimation of population density of Pythium intermedium in forest soils, 2010.
6. Schroeder K.L. et al. Identification and quantification of pathogenic Pythium spp. from soils in eastern Washington using real-time polymerase chain reaction, 2006.
7. Wang P.H. et al. Species-specific PCR primers for Pythium developed from ribosomal ITS1 region, 2003.
Information about the project
Surname Name
Talykh Dar'ya Andreyevna
Project title
The development of test systems for the diagnosis of plant pathogens of Pythium sp.
Summary of the project
The work is devoted to the developing of the PCR test system consisting of two pairs of primers for two molecular markers and allowing to reveal presence of Pythium species in samples of water, soil or plant tissue.
Keywords
Pythium, test system, diagnostics, PCR, blackleg, root decay, infestation