Изучение характера повреждений эритроцитов человека в условиях гипергликемии различной степени

Изучали состояние системы гемоглобина и мембраны эритроцитов человека в условиях гипергликемии различной степени. Гипергликемия 15-20 мМ/л сопровождается ростом мет- и гликозилированной формы гемоглобина, увеличением мембраносвязанного гемоглобина. По данным РАМАН-спектроскопии растет относительная способность гемоглобина к связыванию лигандов: 2,3-дифосфоглbцерата и Н+, так как снижается количество оксиформы гемоглобина. Степень гликозилированности мембранных белков нарастает по мере роста гипергликемии.

Целью данного исследования стало изучение влияния гипергликемии на кислородтранспортную функцию эритроцитов и скорость процессов эриптоза.
Задачи исследования:
1. Определить соотношение форм гемоглобина в эритроцитах человека, инкубируемых при концентрации глюкозы в среде 5, 10, 15 и 20мМ/л;
2. Оценить относительную способность гемоглобина к связыванию лигандов при различной концентрации глюкозы в среде;
3. Изучить степень гликозилированности гемоглобина и мембраны эритроцитов человека в условиях концентрации глюкозы в среде 5, 10, 15 и 20мМ/л;
4. Измерить активность НАДН-метгемоглобинредуктазы в условиях гипергликемии различной степени выраженности;
5. Оценить мембранную проницаемость эритроцитов по выходу пептидных соединений в инкубационную среду.

Различные физиологические и патологические состояния сопровождаются увеличением содержания глюкозы в плазме крови, что ускоряет вероятность протекания реакций неферментативного гликозилирования белков за счет неспецифической агрегации белковых молекул, изменения белок-белковых и белок-липидных взаимодействий. Гликозилирование белков мембран эритроцитов и гемоглобина увеличивает тенденцию адгезии к эндотелиальным клеткам, дестабилизирует мембрану, изменяет вязкоэластические свойства эритроцитов и их форму. Все это может приводить к снижению кислородтранспортной функции эритроцитов и снижению времени их жизни за счёт развития апоптоза или гемолитического разрушения клеток.

 

Материалы и методы

Исследования проводили на фракции чистых эритроцитов, полученной из свежезабранной с антикоагулянтом донорской крови (Самарская областная станция переливания крови). Средний возраст доноров составил 28,4±1,7 лет. Эритроциты отмывали 4-х кратно до получения чистых фракций раствором PBS в режиме 600g, 10 минут, t +4ºС (Центрифуга ЦРЛ-1, Россия). Инкубацию эритроцитов проводили в растворе Рингера-Локка в соотношении 2:1 при 37ºС в течение 30 минут, при осторожном перемешивании каждые 5 минут (во избежание гемолиза). Используемый раствор Рингера-Локка различался содержанием глюкозы (нормогликемия – 5 мМ/л глюкозы; гипергликемия – 10; 15 и 20 мМ/л глюкозы). Инкубационную среду отделяли центрифугированием в том же режиме, в эритроцитах определяли показатели состояния гемоглобина (методом спектрофотометрии и рамановской спектрометрии) [6] и активность НАДН-метгемоглобинредуктазы [7], степень гликозилированности мембран эритроцитов [8].   Для регистрации показателей использовали также спектрофотометр фирмы Schimadzu 1200 (Япония) и Раман спектрометр in via Raman Microspore  (Renishaw, Англия) с короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 нм). Для возбуждения рамановских спектров использовался лазер (длина излучения 532 нм, мощность излучения 5 мВт, объектив 5х). Оцифрованные спектры обработаны в программе OriginPro 8. 

Инкубация эритроцитов (Er) в условиях гипергликемии(ГГ) сопровождается достоверным снижением уровня ОкНb в условиях ГГ 15 и 20 мМ/л (3 и 4% соответственно). Таким образом, наблюдается ускорение процесса дезоксигенации Нb, что сопровождается достоверным ростом ДОкНb при 15 мМ/л - на 4%, при 20 мМ/л - на 3%. Увеличение глюкозы в среде до 10 мМ/л  приводит к увеличению содержания МетHb на 3%, а рост уровня ГГ до 15-20 мМ/л - на 19 и 16 %.  Значительного повышения скорости метгемоглобинобразования не отмечается, возможно, за счет увеличения НАДН-метгемоглобинредуктазной активности. Рост уровня МетHb в среде сопровождается параллельным повышением уровня МCHb, также зависимого от степени ГГ: при 10 мМ/л прирост на 28%, при 15мМ/л – на 48% и почти в 2 раза уровень МСНb возрастает при 20 мМ/л. 

При 30-ти минутной инкубации клеток повышение гликозилированности Hb наблюдается только при концентрации глюкозы 20 мМ/л. Наибольшее влияние ГГ оказывает, исходя из полученных данных, на степень гликирования белков эритроцитарных мембран: для 10 мМ/л глюкозы в среде прирост составил 67%, для 15мМ/л – 89%, для 20мМ/л – 179% 

Результаты РАМАН-спектроскопии подтвердили данные о снижении количества ОкНb в условиях гипергликемии 15 и 20 мМ/л. Это свидетельствует о сдвиге константы диссоциации в сторону образования ДОкНb, характеризующегося напряженной конформацией молекулы данного белка, что видно по снижению колебаний метиновых мостиков. Увеличение сродства Hb к лигандам вероятно обусловлено  повышением данного показателя к 2,3-дифосфоглицерату и Н⁺, что будет способствовать диссоциации кислорода с молекулой Hb. Уровень 2,3-дифосфоглицерата и ионов водорода, в свою очередь, увеличивается за счет активации гликолиза, которая обусловлена взаимодействием ДОкНb с белком полосы 3.

В условиях НГ через 30 минут инкубации при 37ºС в инкубационной среде обнаруживаются от 1 до 3-х пептидных соединений с М.М. от 0,7 до 8,0 Да и 2 белка М.М. 60,5 и 219 Да. Повышение уровня глюкозы сопровождается небольшим увеличением М.М. вышедших пептидных соединений: 3-15 Да. Белки же  обнаруживаются сходной М.М. Наибольшее разнообразие выхода белков наблюдается при увеличении степени гликемии до 15 мМ/л: появляются высокомолекулярные белковые соединения (457; 953; 1376,8), среда приобретает розоватый оттенок, свидетельствующий о выходе Hb. Пептидные соединения также разнообразны: от 1 до 24 Да. Пептидные соединения, выделяемые в условиях ГГ 20мМ/л,  аналогичны НГ, обнаруживается меньше высокомолекулярных белков, чем в условиях ГГ 15 мМ/л. Данные электрофореза подтверждаются также снижением общего содержания пептидных соединений в условиях ГГ 20 мМ/л по сравнению с 15 мМ/л.

Результаты проведенных исследований дают возможность предполагать, что в условиях ГГ наиболее вероятными являются повреждение и гибель Er по механизму увеличения мембранной проницаемости и гемолиза, чем эриптоза.

 

1.Базарнова Ю.Г., Бурова Т.Е. Определение активности внутриклеточных протеолитических ферментов мышечной ткани / под ред. Н.А. Уваровой, 2-е изд. СПб.СПбГУН и ПТ, 2008. -12с.
2 .Low P.S., Westfall M.A. Characterization of the reversible conformation equilibrium of the cytoplasmic domain of erythrocyte membrane band 3.//J. Biol. Chem., 1984259, P.10238-10246.
3. Sega M.F., Chu H., Christian J., Low P.S. Interaction of deoxhemoglobin with the cytoplasmatic domain of murine erythrocyte band 3 //Biochemestry, 2012. 51 3264-3272.
4. Лунева О.Г., Сидоренко С.В., Максимов Г.В., Григорьчик. Эритроциты как регуляторы сосудистого тонуса //Биологические мембраны. 2015, том 32, №4, с.223-234.
5. Lewis I.A., Campanella M.E., Markley J.L., Low P.S. Role of band 3 in regulating metabolic flux of red blood cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106, 18516-18520.

Studied the system status of hemoglobin, membrane and proteolytic activity of human erythrocytes under conditions of hyperglycemia of varying degrees. Hyperglycemia 15-20 mm/l characterized by a rise in meth- and glycosylated forms of hemoglobin, increasing membrane-bound hemoglobin. According to the RAMAN spectroscopy increases the relative ability of hemoglobin to bind ligands: 2,3-diphosphoglycerate and H+, as it reduces the amount of oxyhemoglobin. The degree of glycosylated proteins membrane incre ases as the growth of hyperglycemia. In conditions of hyperglycemia 15-20 mm/l, the decrease of the activity of µ-calpain, increases the total trypsin-like activity in cytosol. The obtained data indicate that inhibition of calcium-dependent processes, which suggests a greater likelihood of hemolytic cell death than apoptosis.