Регистрация / Вход
Прислать материал

Изучение характера повреждений эритроцитов человека в условиях гипергликемии различной степени

Сведения об участнике
ФИО
Пестрякова Анастасия Алексеевна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Самарский национальный исследовательский университет имени академика С.П. Королёва
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Фундаментальная медицина и физиология
Тема
Изучение характера повреждений эритроцитов человека в условиях гипергликемии различной степени
Резюме
Изучали состояние системы гемоглобина и мембраны эритроцитов человека в условиях гипергликемии различной степени. Гипергликемия 15-20 мМ/л сопровождается ростом мет- и гликозилированной формы гемоглобина, увеличением мембраносвязанного гемоглобина. По данным РАМАН-спектроскопии растет относительная способность гемоглобина к связыванию лигандов: 2,3-дифосфоглbцерата и Н+, так как снижается количество оксиформы гемоглобина. Степень гликозилированности мембранных белков нарастает по мере роста гипергликемии.
Ключевые слова
эритроциты человека, гипергликемия, система гемоглобина
Цели и задачи
Целью данного исследования стало изучение влияния гипергликемии на кислородтранспортную функцию эритроцитов и скорость процессов эриптоза.
Задачи исследования:
1. Определить соотношение форм гемоглобина в эритроцитах человека, инкубируемых при концентрации глюкозы в среде 5, 10, 15 и 20мМ/л;
2. Оценить относительную способность гемоглобина к связыванию лигандов при различной концентрации глюкозы в среде;
3. Изучить степень гликозилированности гемоглобина и мембраны эритроцитов человека в условиях концентрации глюкозы в среде 5, 10, 15 и 20мМ/л;
4. Измерить активность НАДН-метгемоглобинредуктазы в условиях гипергликемии различной степени выраженности;
5. Оценить мембранную проницаемость эритроцитов по выходу пептидных соединений в инкубационную среду.
Введение

Различные физиологические и патологические состояния сопровождаются увеличением содержания глюкозы в плазме крови, что ускоряет вероятность протекания реакций неферментативного гликозилирования белков за счет неспецифической агрегации белковых молекул, изменения белок-белковых и белок-липидных взаимодействий. Гликозилирование белков мембран эритроцитов и гемоглобина увеличивает тенденцию адгезии к эндотелиальным клеткам, дестабилизирует мембрану, изменяет вязкоэластические свойства эритроцитов и их форму. Все это может приводить к снижению кислородтранспортной функции эритроцитов и снижению времени их жизни за счёт развития апоптоза или гемолитического разрушения клеток.

 

Методы и материалы

Материалы и методы

Исследования проводили на фракции чистых эритроцитов, полученной из свежезабранной с антикоагулянтом донорской крови (Самарская областная станция переливания крови). Средний возраст доноров составил 28,4±1,7 лет. Эритроциты отмывали 4-х кратно до получения чистых фракций раствором PBS в режиме 600g, 10 минут, t +4ºС (Центрифуга ЦРЛ-1, Россия). Инкубацию эритроцитов проводили в растворе Рингера-Локка в соотношении 2:1 при 37ºС в течение 30 минут, при осторожном перемешивании каждые 5 минут (во избежание гемолиза). Используемый раствор Рингера-Локка различался содержанием глюкозы (нормогликемия – 5 мМ/л глюкозы; гипергликемия – 10; 15 и 20 мМ/л глюкозы). Инкубационную среду отделяли центрифугированием в том же режиме, в эритроцитах определяли показатели состояния гемоглобина (методом спектрофотометрии и рамановской спектрометрии) [6] и активность НАДН-метгемоглобинредуктазы [7], степень гликозилированности мембран эритроцитов [8].   Для регистрации показателей использовали также спектрофотометр фирмы Schimadzu 1200 (Япония) и Раман спектрометр in via Raman Microspore  (Renishaw, Англия) с короткофокусным высокосветосильным монохроматором (фокусное расстояние не более 250 нм). Для возбуждения рамановских спектров использовался лазер (длина излучения 532 нм, мощность излучения 5 мВт, объектив 5х). Оцифрованные спектры обработаны в программе OriginPro 8. 

Описание и обсуждение результатов

Инкубация эритроцитов (Er) в условиях гипергликемии(ГГ) сопровождается достоверным снижением уровня ОкНb в условиях ГГ 15 и 20 мМ/л (3 и 4% соответственно). Таким образом, наблюдается ускорение процесса дезоксигенации Нb, что сопровождается достоверным ростом ДОкНb при 15 мМ/л - на 4%, при 20 мМ/л - на 3%. Увеличение глюкозы в среде до 10 мМ/л  приводит к увеличению содержания МетHb на 3%, а рост уровня ГГ до 15-20 мМ/л - на 19 и 16 %.  Значительного повышения скорости метгемоглобинобразования не отмечается, возможно, за счет увеличения НАДН-метгемоглобинредуктазной активности. Рост уровня МетHb в среде сопровождается параллельным повышением уровня МCHb, также зависимого от степени ГГ: при 10 мМ/л прирост на 28%, при 15мМ/л – на 48% и почти в 2 раза уровень МСНb возрастает при 20 мМ/л. 

При 30-ти минутной инкубации клеток повышение гликозилированности Hb наблюдается только при концентрации глюкозы 20 мМ/л. Наибольшее влияние ГГ оказывает, исходя из полученных данных, на степень гликирования белков эритроцитарных мембран: для 10 мМ/л глюкозы в среде прирост составил 67%, для 15мМ/л – 89%, для 20мМ/л – 179% 

Результаты РАМАН-спектроскопии подтвердили данные о снижении количества ОкНb в условиях гипергликемии 15 и 20 мМ/л. Это свидетельствует о сдвиге константы диссоциации в сторону образования ДОкНb, характеризующегося напряженной конформацией молекулы данного белка, что видно по снижению колебаний метиновых мостиков. Увеличение сродства Hb к лигандам вероятно обусловлено  повышением данного показателя к 2,3-дифосфоглицерату и Н+, что будет способствовать диссоциации кислорода с молекулой Hb. Уровень 2,3-дифосфоглицерата и ионов водорода, в свою очередь, увеличивается за счет активации гликолиза, которая обусловлена взаимодействием ДОкНb с белком полосы 3.

В условиях НГ через 30 минут инкубации при 37ºС в инкубационной среде обнаруживаются от 1 до 3-х пептидных соединений с М.М. от 0,7 до 8,0 Да и 2 белка М.М. 60,5 и 219 Да. Повышение уровня глюкозы сопровождается небольшим увеличением М.М. вышедших пептидных соединений: 3-15 Да. Белки же  обнаруживаются сходной М.М. Наибольшее разнообразие выхода белков наблюдается при увеличении степени гликемии до 15 мМ/л: появляются высокомолекулярные белковые соединения (457; 953; 1376,8), среда приобретает розоватый оттенок, свидетельствующий о выходе Hb. Пептидные соединения также разнообразны: от 1 до 24 Да. Пептидные соединения, выделяемые в условиях ГГ 20мМ/л,  аналогичны НГ, обнаруживается меньше высокомолекулярных белков, чем в условиях ГГ 15 мМ/л. Данные электрофореза подтверждаются также снижением общего содержания пептидных соединений в условиях ГГ 20 мМ/л по сравнению с 15 мМ/л.

Результаты проведенных исследований дают возможность предполагать, что в условиях ГГ наиболее вероятными являются повреждение и гибель Er по механизму увеличения мембранной проницаемости и гемолиза, чем эриптоза.

 

Используемые источники
1.Базарнова Ю.Г., Бурова Т.Е. Определение активности внутриклеточных протеолитических ферментов мышечной ткани / под ред. Н.А. Уваровой, 2-е изд. СПб.СПбГУН и ПТ, 2008. -12с.
2 .Low P.S., Westfall M.A. Characterization of the reversible conformation equilibrium of the cytoplasmic domain of erythrocyte membrane band 3.//J. Biol. Chem., 1984259, P.10238-10246.
3. Sega M.F., Chu H., Christian J., Low P.S. Interaction of deoxhemoglobin with the cytoplasmatic domain of murine erythrocyte band 3 //Biochemestry, 2012. 51 3264-3272.
4. Лунева О.Г., Сидоренко С.В., Максимов Г.В., Григорьчик. Эритроциты как регуляторы сосудистого тонуса //Биологические мембраны. 2015, том 32, №4, с.223-234.
5. Lewis I.A., Campanella M.E., Markley J.L., Low P.S. Role of band 3 in regulating metabolic flux of red blood cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106, 18516-18520.
Information about the project
Surname Name
Pestryakova Anastasia
Project title
The study of the nature of the damage of human erythrocytes under conditions of hyperglycemia of varying degrees
Summary of the project
Studied the system status of hemoglobin, membrane and proteolytic activity of human erythrocytes under conditions of hyperglycemia of varying degrees. Hyperglycemia 15-20 mm/l characterized by a rise in meth- and glycosylated forms of hemoglobin, increasing membrane-bound hemoglobin. According to the RAMAN spectroscopy increases the relative ability of hemoglobin to bind ligands: 2,3-diphosphoglycerate and H+, as it reduces the amount of oxyhemoglobin. The degree of glycosylated proteins membrane incre ases as the growth of hyperglycemia. In conditions of hyperglycemia 15-20 mm/l, the decrease of the activity of µ-calpain, increases the total trypsin-like activity in cytosol. The obtained data indicate that inhibition of calcium-dependent processes, which suggests a greater likelihood of hemolytic cell death than apoptosis.


Keywords
human erytrocytes, hemoglobin, hyperglycemia