Биосинтез бактериальной целлюлозы на ферментативных гидролизатах технической целлюлозы

В данной работе рассмотрены новые углеводные субстраты для бактерий-продуцентов целлюлозы в условиях стабильности микробиологического консорциума. Приводится сравнение продуктивности микроорганизмов по бактериальной целлюлозе на различных питательных средах.

Цель: исследование динамики ассимиляции сахаров и синтеза целлюлозы уксуснокислыми бактериями р. Acetobacter в симбиотическом комплексе в средах на основе ферментативного гидролизата лигноуглеводного сырья.
Задачи:
-Получить накопительную культуру симбиоза бактерий рода Acetobacter и дрожжей (Medusomyces gisevii J. Lindau);
-Изучить морфологические и культуральные свойства симбиотических микроорганизмов в консорциуме;
-Изучить эффективность ассимиляции глюкозы и восстанавливающих сахаров в средах на основе ферментативного гидролизата небелёной сульфатной и беленой сульфитной хвойной целлюлозы;
-Оценить выход бактериальной целлюлозы, полученной при культивировании симбиотической культуры в средах на основе ферментативного гидролизата небелёной сульфатной и беленой сульфитной хвойной целлюлозы.
-Исследовать фракции белков, выделяемые клетками при биосинтезе бактериальной целлюлозы с использованием sds-Na-ПААГ

Целлюлоза в современном мире остается наиболее востребованным биополимером. Наибольший практический интерес в качестве альтернативного способа получения целлюлозы представляет микробиологический способ, реализуемый бактериальными продуцентами.

Актуальной задачей является поиск новых углеводных субстратов для культивирования бактерий-продуцентов целлюлозы. В качестве таких субстратов представляет интерес лигноуглеводное сырье и отходы растительного происхождения. Эффективность культивирования в этом случае обусловлена динамикой синтеза целлюлозы уксуснокислыми бактериями р. Acetobacter в симбиотическом комплексе в средах на основе ферментативного гидролизата лигноуглеводного сырья. 

Бактериальную целлюлозу получали, культивируя симбиоз бактерий рода Acetobacter и дрожжей на синтетической среде и ферментолизате в статических условиях при 25°С.

В качестве сырья для ферментолизата использовали образцы небелёной сульфатной и беленой сульфитной хвойной целлюлозы. Образцы суспендировали и обрабатывали комплексным ферментным препаратом на основе рекомбинантного штамма рода Penicillium, с расходом 13 мг/г в течение 48 ч при 50 °С. Фугованием  в течение 15 мин отделяли гидролизат.

Полученные среды стерилизовали перед внесением инокулята.

Ассимиляцию сахаров определяли по методу Нельсона-Шомоди. Для мониторинга ассимиляции клетками глюкозы в процессе культивирования ее концентрацию определяли на приборе ЭНЗИСКАН-ультра.

Морфологические особенности клеток и структуры бактериальной целлюлозы изучали при помощи электронного растрового микроскопа Zeiss SIGMA VP.

Для фракционирования белковых препаратов и исследования их состава использовали классическую методику денатурирующего гель-электрофореза. В ходе исследования использовали ячейку для электрофорезаMINI-PROTEAT и 12%-ный полиакриламидный гель (ПААГ).

Проведен анализ влияния малоизученных технических (лигноуглеводных) субстратов на эффективность бактериального синтеза целлюлозы.

Установлено, что в ферментативном гидролизате небеленой сульфатной хвойной целлюлозы ассимиляция глюкозы протекает в 6 раз эффективнее, чем в ферментализате беленой сульфитной целлюлозы.

Выход бактериальной целлюлозы полученной при культивировании симбиоза на ферментализате беленой сульфитной целлюлозы в 5 раз больше, чем в ферментативном гидролизате на основе образцов небеленой сульфатной целлюлозы.

По результатам электрофореза установлено, что широкий спектр белков с молекулярной массой25-60 кДа характерен для симбиоза.

Для сравнения анализировали деструктированную биомассу чистой культуры Acetobacter xylinum, установили низкомолекулярные фракции белков 10-11 кДа, несущие главным образом рибосомальные функции, а также белки 15-25 кДа

Исследование микроморфологического строения экзополисахарида, формирующего матрицу бактериальной целлюлозы, показало наличие однородных фибрилл целлюлозы диаметром 50 нм, уложенных в беспорядочную матрицу, включающую клетки микроорганизмов

При изучении морфологических и культуральных свойств продуцента бактериальной целлюлозы показано, что при формировании пленки целлюлозы развивается симбиотический консорциум, причем синтез фибрилл целлюлозы обеспечивается бактериями р.Acetobacter, а дрожжи стабилизируют их популяцию.

 

1. Гладышева Е.К., Скиба Е.А. Влияние углеродного состава питательных сред на продуктивность целлюлозосинтезирующих бактерий (обзор) // Ползуновский вестник. – 2014. - № 3
2. Чекушина А.В. Целлюлолитические ферментные препараты на основе грибов Trichoderma, Penicillium и Myceliophtora с увеличенной гидролитической активностью: автореферат дис. ... канд.хим.наук, М., 2013. –23 с
3. Nelson, N., J. Bid. Chem., 163, 375 (1944)
4. Somogyi, M., J. Biol. Chem, 160,61 (1945)
5.Стручкова И.В.; Кальясова Е.А. Теоретические и практические основы проведения электрофореза белков в полиакриламидном геле Нижний Новгород, 2012.-60с.

In this paper, the new carbohydrate substrates for bacteria-producers of pulp in terms of stability of the microbial consortium. A comparison of the productivity of microorganisms on bacterial cellulose in different culture media.