Новый иммерсионный способ создания тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины

Клеточные технологии являются перспективным направлением для решения проблемы замещения дефектов хрящевой ткани. В хондропластикие применяют аутологичные и аллогенные хондроциты, мезенхимальные стромальные клетки. Однако остаётся открытым вопрос выбора источника для получения клеточного материала, а также поиска оптимальных способов доставки и фиксации клеток в органезме.

С целью получения клеточно-тканевых трансплантатов для хондропластики, мы использовали трехмерный резорбируемый наноструктурированный бионоситель – аллогенную деминерализованную лиофилизированную спонгиозу и культуры клеток, полученные из реберного хряща.

Цель исследования – разработать новый способ создания тканеинженерных конструкций для регенеративной медицины.
Задачи исследования:
1. Получить и идентифицировать культуру хондральных клеток для создания клеточно-тканевого трансплантата.
2. Оценить структуру, а также качественный и количественный состав 3D-бионосителя с помощью современных оптических методов.
3. Дать характеристику структуры, качественного и количественного состава тканеинженерных конструкций, полученных в условиях СО2-инкубатора и новым иммерсионным способом.
4. Изучить газовый состав культуральной среды, в которой происходило выращивание трансплантатов для хондропластики.
5. Изучить в экспериментах на кроликах характер регенеративного процесса при использовании тканеинженерных конструкций, полученных разными способами.

На данный момент известные консервативные и хирургические способы лечения деструктивно-дистрофических заболеваний суставного хряща не обеспечивают полной регенерации с образованием органотипичной ткани и восстановлением функций сустава.

Клеточные технологии являются перспективным направлением для решения проблемы замещения дефектов хрящевой ткани. В хондропластикие применяют аутологичные и аллогенные хондроциты, мезенхимальные стромальные клетки. Однако остаётся открытым вопрос выбора источника для получения клеточного материала, а также поиска оптимальных способов доставки и фиксации клеток в органезме.

Клетки будут выращены из гиалинового хряща кролика в лаборатории культур клеток ИЭМБ СамГМУ по методу Brittberg et al. в модификации при температуре 37°С с 5% содержанием СО₂ и постоянной влажности в MCO-18AC (Sanyo, Япония) в пластиковых культуральных флаконах (Orange Scientific, Бельгия). После 3-кратного пассирования будет получена чистая культура хондральных клеток. Идентификация клеток будет проведена с использованием морфологических, морфометрических, биохимических, иммуногистохимических методов и проточной цитометрии.

3D-носителя - аллогенная деминерализованная лиофилизированная спонгиоза «Лиопласт»^®.

Для подтверждения наличия клеток на бионосителе будут использованы растровая электронная (JEOL JSM-6390A Analysis Station, Япония) и конфокальная (стенд реализованный на базе конфокального оптического микроскопа Olympus CX-71 и лазерного комбайна ANDOR) микроскопия а также ЛДГ-теста.

Клетки будут высеяны на пористый 3D-носитель в дозе 9,5х10⁴. Размер носителя 3х3х3 мм. Полученный клеточный продукт будет помещен в пробирки (Spektar, Сербия), заполненные ростовой средой, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки.

Для оценки регенеративного потенциала созданных клеточно-тканевых трансплантатов будут проведены экспериментальные исследования in vivo на кроликах породы «Шиншилла» 9-12 месяцев, масса – 2,5-3 кг, которым будет выполнена хондропластика костно-хрящевых дефектов коленного сустава.

Практическая значимость

Новый способ получения тканеинженерных конструкций in vitro позволит выявлять закономерности и особенности процессов, происходящих в биологических системах в условиях космического полета.

Комплексная оценка структуры, качественных и количественных характеристик трансплантатов, полученных новым способом, а также результаты их применения in vivo позволят стандартизировать требования, предъявляемые к клеточно-тканевым продуктам и обеспечить их высокий регенеративный потенциал.

1. Волова Л.Т., Белозерцева Е.А., Гавеля Е.Ю. Регуляция регенераторных процессов в костной ткани при применении деминерализованной спонгиозы, изготовленной по технологии «Лиопласт®» // Вопросы морфологии XXI века. Вып. 2. СПб. 2010. С. 82-86.
2. Маланин Д.А. Восстановление повреждений хряща в коленном суставе: экспериментальные и клинические аспекты [Текст] / Д.А. Маланин, В.Б. Писарев, В.В. Новочадов. – Волгоград, 2010. – 455 с.
3. Татаренко-Козмина Т.Ю., Матвеева В.Н. с соавт. Применение мезенхимальных стромальных клеток, нанесённых на композиционные материалы для оптимизации регенерации костной ткани / Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2007. №1. С.8-10.
4. López E, Figueroa S et al. Apoptosis and necrosis: two distinct events induced by cadmium in cortical neurons in culture // Br J Pharmacol. 2003 Mar;138(5):901-11.

Finding ways of effective tissue recovery is an important task of regenerative medicine. Hyaline cartilage regeneration remains an unresolved issue. These days there are some conservative and surgical methods that are used to restore the function of articular cartilage. However, these methods do not guarantee full function regeneration. Most commonly, the injured parts of hyaline cartilage are filled with fibrous tissue.
Cellular technology is a powerful tool that can solve the problem of cartilage tissue regeneration. Chondroplastics uses cartilage cells and mesenchymal stromal cells. However, where to find the source of cell material is still an open question. Also, it is necessary to find the best way to deliver and anchor cells in target-tissue. Currently cellular transplantology uses a lot of synthetic and biogenic carriers. However, a 3D-biodegradable matrix is most preferable in chondroplastics.
We offer a 3D-biocarrier made from allogenic demineralized lyophilized spongiosis and a cell culture from hyaline cartilage. This will be used to make cellular tissue transplants for chondroplatics.

Our research goal is to create a new method of tissue-engineered constructions for regenerative medicine.
Our research objectives are
1. To obtain and identify a chondral cell culture to create a cellular-tissue transplant.
2. To estimate the structure and content of the 3D-biocarrier with the help of modern optical methods.
3. To give a structure characteristic as well as qualitative and quantitative composition of the tissue-engineering constructions which were received at 5% CO2 in hypoxic conditions.
4. To study the gas composition of the culture liquid in which the transplants were grown.
5. To study the character of the regenerative process which involves the usage of tissue-engineered constructions.

Objects Used in Research:
1. Allogenic demineralized lyophilized spongiosis
2. Human and rabbit chondroblasts
3. Culture liquid
4. Chinchilla Rabbits

Methods and Materials
Research will be carried out in two stages: in vitro – making and full estimation of the allogenic demineralized lyophilized spongiosis tissue-engineered construction. The next method, in vivo – biocompatibility and effectiveness study of the final product which will be carried out in experiments on lab animals.
The cells will be grown from hyaline cartilage in the cell culture laboratory of Institute of Experimental Medicine and Biotechnology. Cells will be grown at the temperature of 37 degrees, 5% CO2 and constant humidity. The culture will be identified in the third passage.
As a biocarrier we are going to use allogenic demineralized lyophilized spongiosis produced with “Lyoplast” technology.
Raman-scattering spectroscopy will be used to characterize the biocarrier.
The cellular-tissue transplant will be made by planting cartilage cells into the carrier.
Experimental research will be carried out on 9 to 12 months old Chinchilla Rabbits in order to estimate the regenerative potential of the final product. Knee-joint chondroplastics will be performed.

Practical Relevance
By means of an integrated tissue-engineered construction structure and composition estimation we will be able to standardize the requirements for cellular-tissue products as well as guarantee their high regenerative potential.