Ограничение питательных веществ в комбинированной терапии опухолей: изучение молекулярных механизмов усиления апоптотической гибели опухолевых клеток.

Главной задачей онкологии является увеличение эффективности противоопухолевых препаратов, способных запускать апоптотическую гибель опухолевых клеток. Одним из потенциальных подходов, увеличивающих эффективность лечения такими препаратами, является комбинирование последних с ограничением питательных веществ (ОПВ). В работе было показано, что культивирование опухолевых клеток в бессывороточной среде - in vitro модели кратковременного ОПВ - в комбинации с ДНК-повреждающим агентом ускоряет апоптотические процессы (расщепление и активирование каспаз, деградацию белка PARP). Подобный эффект, вероятно, обусловлен деградацией антиапоптотических белков.

Цель – исследовать механизм комбинаторного воздействия ДНК-повреждающего химиотерапевтического агента цисплатина и ограничения питательных веществ на клетки раковых линий.
Задачи:
1) Определение влияния удаления сыворотки на запуск апоптоза в исследуемых клеточных линиях
2) Определение вклада аутофагии в модуляцию апоптотического ответа в исследуемых условиях
3) Поиск инициаторных каспаз, ответственных за запуск клеточной гибели в исследуемых экспериментальных группах
4) Определение механизмов, способствующих усилению апоптоза при удалении сыворотки из среды

Одной из главных задач медицины в настоящее время является борьба со злокачественными опухолями. Апоптоз – процесс программируемой клеточной гибели. Действие многих противоопухолевых препаратов, содержащих ДНК-повреждающие агенты, основано на запуске апоптоза в опухолевых клетках. Однако эффективность воздействия монотерапии на опухолевые клетки в настоящее время ограничена. Следовательно, необходим поиск различных комбинаторных подходов в противоопухолевой терапии. Одним из многообещащих подходов является комбинация ограничения питательных веществ с противоопухолевыми препаратми. Однако механизмы усиления клеточной гибели при подобной комбинированной терапии остаются малоизученными. 

В ходе работы использовали следующие опухолевые клеточные линии: аденокарцинома шейки матки HeLa, карцинома яичника Caov-4 и карцинома яичника линии Caov-4-shRNA-каспаза-2, дефицитной по каспазе-2.
Условия кратковременного ОПВ in vivo имитировали удалением сыворотки из культуральной среды. Клеточную гибель индуцировали при помощи ДНК-повреждающего агента цисплатина.
Эффекты воздействия удаления сыворотки из среды и/или ДНК-повреждающего агента анализировали при помощи различных биохимических методов (Вестерн-блот анализа, проточной цитофлуориметрии, измерения ферментативной активности каспаз, гель-фильтрации).

Целью работы было изучить механизм комбинаторного воздействия ДНК-повреждающего химиотерапевтического агента цисплатина и удаления сыворотки из среды (как модели ОПВ in vivo) на клетки раковых линий. Удаление сыворотки из среды усиливало и в значительной степени влияло на скорость появления апоптотических маркеров в исследуемых опухолевых линиях. Мы изучили, какие инициаторные каспазы могут отвечать за запуск апоптоза в условиях комбинаторного воздействия цисплатина и SD. Несмотря на более ранний процессинг каспаз в условиях двойного стресса, не было выявлено существенных различий в роли инициаторных каспаз после обработки клеток цисплатином в стандартных условиях или условиях SD. Следовательно, актуальным оставался поиск механизмов, ведущих к более раннему запуску процесса апоптоза при удалении сыворотки из среды. В качестве возможного механизма рассматривалась роль аутофагии в модуляции апоптотического ответа в условиях SD. Несмотря на наличие большого количества питательных веществ в сыворотке, удаление последней не вело к существенному усилению аутофагии. Более того, добавление ингибиторов аутофагии к клеткам, культивируемым в условиях двойного стресса, не вызывало изменении уровня апоптотической гибели. Так как сыворотка содержит большое количество разнообразных ростовых факторов, ее удаление может вести к изменению уровня стимуляции рецепторов, ответственных за выживание и пролиферацию клеток, и, следовательно, ослаблению митогенных каскадов. Действительно, в условиях комбинирования SD с цисплатином в существенной степени ослаблялось фосфорилирование ERK-1/2. Одним из последствий ослабления сигнальных каскадов, идущих через данные белки, может быть уменьшение стабильности антиапототических белков. В качестве одного из таких белков был рассмотрен белок Mcl-1. Действительно, после обработки клеток цисплатином наблюдалась быстрая деградация данного белка, которая была выражена в значительно большей степени в условиях SD. Одним из последствий деградации антиапоптотических белков семейства Bcl-2 является активация каспазы-9 в составе высокомолекулярного комплекса – апоптосомы. В нашей экспериментальной модели образование данного комплекса наблюдалось быстрее в условиях комбинированного воздействия цисплатина и SD. Полученные выше данные указывают на то, что деградация антиапоптотических белков может служить одним из основных механизмов, повышающих чувствительность опухолевых клеток к цисплатину при удалении сыворотки из среды культивирования. Таким образом, условия SD имитируют краткосрочное ОПВ in vivo, которое является многообещающим способом увеличения чувствительности опухолей к применяемым в клинике противоопухолевым препаратам, и, следовательно, полученные данные имеют существенную практическую значимость для понимания процессов, лежащих в основе комбинированной терапии опухолей. 

Meynet O. et al. Caloric restriction modulates Mcl-1 expression and sensitizes lymphomas to BH3 mimetic in mice //Blood.
Shi Y. et al. Starvation-induced activation of ATM/Chk2/p53 signaling sensitizes cancer cells to cisplatin //BMC cancer.
Heilbronn L. K. et al. Alternate-day fasting in nonobese subjects: effects on body weight, body composition, and energy metabolism //The American journal of clinical nutrition.
Lee C. et al. Fasting cycles retard growth of tumors and sensitize a range of cancer cell types to chemotherapy //Science translational medicine.
Caffa I. et al. Fasting potentiates the anticancer activity of tyrosine kinase inhibitors by strengthening MAPK signaling inhibition //Oncotarget.
Lee C., Longo V. D. Fasting vs dietary restriction in cellular protection and cancer treatment: from model organisms to patients //Oncogene.

One of the most commonly exploited oncotherapeutic strategies is based on the use of special chemical agents which are able to induce DNA damage and thus trigger apoptotic death of cancer cells. However, these widely used drugs have significant toxic effects because normal cells also undergo apoptosis after treatment. Thus, development of approaches that increase therapeutic effects of anticancer drugs is a topical task of oncomedicine. The combination of calorie restriction (CR) and the chemotherapeutic drugs has been shown to enhance programmed death of cancer cells that will allow decreasing the dose of chemotherapy drugs and reducing their toxicity. In our studies we examined the mechanisms how serum deprivation, which serves as an in vitro model of CR, modulates apoptosis in two cancer cell lines (ovarian carcinoma line Caov-4 and cervical adenocarcinoma line HeLa) in response to treatment with DNA-damaging chemotherapeutic agent, cisplatin. Serum deprivation enhances apoptotic cell death of cancer cells in combination with cisplatin in time-dependent manner what is reflected by different hallmarks of apoptosis, e.g. processing and activation of initiator caspases-2, -8, -9 and executive caspase-3, Annexin V staining, PARP cleavage. Intriguingly, serum deprivation does not trigger autophagy neither with nor without chemotherapeutic agent cisplatin in our experimental model. Our studies suggest that Mcl-1 - one of the key apoptotic regulators - undergoes rapid degradation in response to the combinatorial treatment that promotes apoptosis induction through more rapid caspase-9 activation. As Mcl-1 was shown to be tightly interconnected with mitogenic cascades it might serve as a link between attenuation of growth factor signaling and enhancement of apoptosis caused by serum deprivation. Consequently, serum deprivation seems to mimic the growth factor deprivation rather than significant nutrient restriction that simulates short-term calorie restriction in vivo. Therefore, degradation of antiapoptotic proteins could be one of the mechanisms through which serum deprivation increases cell death of cancer cells that could be applied in anticancer therapy.