Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка противоопухолевого генно-инженерного препарата на основе гена Klotho

Сведения об участнике
ФИО
Мелехин Всеволод Викторович
Вуз
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Медицинские биотехнологии
Тема
Разработка противоопухолевого генно-инженерного препарата на основе гена Klotho
Резюме
Поиск эффективных противоопухолевых средств является актуальнейшей проблемой медицины. Многообещающим направлением развития биотехнологического подхода считается создание генно-инженерных препаратов на основе генов-супрессоров опухолевого роста.
Настоящий проект посвящен разработке препарата, на основе плазмиды с геном Klotho – одним из наиболее перспективных генов-супрессоров.
В работе представлены данные, демонстрирующие эффективность такого подхода: индуцированная гиперэкспрессия гена Klotho в опухолевых клетках подавляет их пролиферативную и клоногенную активность, что сопровождается снижением скорости синтеза нуклеиновых кислот.
Ключевые слова
Клото, противоопухолевый препарат, генно-инженерная терапия
Цели и задачи
Разработка инновационного эффективного и безопасного генно-инженерного противоопухолевого препарата
Введение

Онкопатология занимает второе место в структуре причин смертности населения России. При этом многолетний рост онкозаболеваемости составляет около 2% в год. Этим обусловлена высокая актуальность создания отечественных инновационных противоопухолевых препаратов нового поколения, не подавляющих, но вовлекающих систему иммунитета в ответную реакцию организма на опухоль.

Возможной основой для создания подобного препарата является разработка генно-терапевтического средства на основе генов опухолевой супрессии. Между тем, несмотря на высокую потребность, в России подобных завершенных разработок нет. Таким образом, данный проект, основанный на противоопухолевом действии гена Klotho, может быть охарактеризован как уникальный для РФ.

Методы и материалы

Гиперэкспрессию гена Klotho в культурах опухолевых клеток моделировали посредством липосомальной трансфекции невирусным вектором (плазмидой) с геном секретируемой формы белка Klotho.

Исследования включали опытную и контрольную группы. В опытной группе моделировали гиперэкспрессию гена Klotho. Трансфекцию проводили комплексом липидов Escort III (Sigma Aldrich). Состав среды контрольной группы включал только трансфекционный комплекс Escort III. В качестве модели для исследований применяли культивируемую линию рабдомиосаркомы человека (Rd).

Пролиферативную активность в группах оценивали построением кривых роста с подсчетом клеток раз в двое суток. После статистической обработки данных анализировали построенные графики кривых роста.

Клоногенную активность оценивали при пассировании в низкой посевной концентрации. По истечении 14 суток, определяли количество сформировавшихся колоний.

Для более детального исследования влияния Klotho на опухолевые клетки оценивали концентрацию нуклеиновых кислот в культурах методом спектрофотометрии и с использованием радиоизотопно меченых молекул-предшественников анализировали активность синтеза нуклеиновых кислот.

Статистический анализ проводили в программе RStudio (Version 0.99.491 – RStudio, Inc.), использовали критерий Манна-Уитни. Значение p < 0,05 считали статистически значимым.

Описание и обсуждение результатов

Анализ кривых роста показал, что статистически значимые отличия количества клеток опытной и контрольной групп зафиксированы уже на 4 сутки. Различие количества клеток нарастало по ходу log-фазы. К 8 суткам, перед выходом культур контрольной группы на фазу плато, в опытной группе зарегистрировано на 57,7% (p < 0,01) меньше клеток. Период клеточного удвоения – 56,9 и 40,6 часов в опытной и контрольной группах, соответственно.

При проведении клоногенного анализа в контрольной группе на 1 см2, в среднем, приходилось 1,38 колоний, в опытной группе этот показатель не превышал 0,78. Тем самым, один из характеризующих иммортализованные клетки показателей снижается при гиперэкспрессии Klotho на 43,5% (p < 0,01).

При анализе концентрации нуклеиновых кислот отмечено достоверное снижение показателя в опытной группе уже через 2 суток. В течение log-фазы разница показателя в опытной и контрольной группах нарастала, достигнув максимальной величины к 8 суткам. В опытной группе относительное количество нуклеиновых кислот было на 24,1% (p < 0,01) ниже, чем в контрольной.

Оценка интенсивности синтеза нуклеиновых кислот продемонстрировала то, что индуцированная гиперэкспрессия Klotho способствовала снижению включения общемеченой оротовой кислоты в макромолекулы клеток рабдомиосаркомы за сутки на 13,5% (p < 0,05).

Объяснить зарегистрированные эффекты индуцировнаной гиперэкспрессии гена Klotho на клетки рабдомиосаркомы человека можно с различных позиций, в частности с позиции полифункциональности гена Klotho.

Одним из наиболее хорошо изученных действий Klotho является подавление внутриклеточной сигнальной связи инсулин/инсулин подобный фактор роста 1 (И/ИПФР-1). Предполагается, что это может повлечь за собой повышение экспрессии факторов транскрипции С/ЕВР альфа и бета, тогда как данные факторы определяются как супрессоры развития некоторых онкологических заболеваний. Кроме того, отмечена связь сниженной экспрессии генов PI3K и АКТ, опосредованной ингибированием сигнальной связи инсулин/ИПФР-1, с подавлением пролиферативной активности опухолевых клеток.

Также наблюдаемые эффекты могут быть объяснены влиянием гена на компоненты, регулирующие клеточный цикл. Такими мишенями для Klotho могут служить гены Bax и Bcl-2, уровни которых зависят от активности Klotho. Значимую роль в Klotho-обусловленной опухолевой супрессии играют сигнальные пути.

Привлекают интерес исследования участия различных молекул микроРНК в канцерогенезе. Среди микроРНК, влияющих на развитие опухолей и имеющих связь с геном Klotho, можно отметить miR-339, miR-556 и miR-10b.

Используемые источники
1. Chen B, Wang X, Zhao W, Wu J. Klotho inhibits growth and promotes apoptosis in human lung cancer cell line A549. J Exp Clin Cancer Res. 2010. 19; 29: 99.
2. Mitani H, Ishizaka N, Aizawa T, Ohno M, Usui S, Suzuki T, Amaki T, Mori I, Nakamura Y, Sato M, Nangaku M, Hirata Y, Nagai R. In vivo klotho gene transfer ameliorates angiotensin II-induced renal damage. Hypertension. 2002; 39 :838–843.
3. Li XX, Huang LY, Peng JJ, Liang L, Shi DB, Zheng HT, Cai SJ. Klotho suppresses growth and invasion of colon cancer cells through inhibition of IGF1R-mediated P13K/AKT pathway. Int J Oncol. 2014. 45(2): 611-8.
4. Chen B, Wang X, Zhao W, Wu J. Klotho inhibits growth and promotes apoptosis in human lung cancer cell line A549. J Exp Clin Cancer Res. 2010. 19; 29: 99.
5. Mehi SJ, Maltare A, Abraham CR, King GD. MicroRNA-339 and microRNA-556 regulate Klotho expression in vitro //Age. – 2014. – Т. 36 – №. 1 – С. 141-149
Information about the project
Surname Name
Melekhin Vsevolod
Project title
Development of genetically engineered anticancer drug based on gene Klotho
Summary of the project
The search for effective anti-tumor agents is the most urgent problem of medicine. A promising direction in the development of biotechnological approach is the creation of genetically engineered drugs based on tumor suppressor gene.
This project is dedicated to the development of the drug, based on a plasmid with the gene Klotho - one of the most promising tumor suppressor genes.
The paper presents data demonstrating the effectiveness of this approach: the induced overexpression of Klotho gene in tumor cells inhibits their proliferation and clonogenic activity, which is accompanied by a decrease in the rate of synthesis of nucleic acids.
Keywords
Klotho, an anticancer drug, genetic engineering treatment