Выживаемость бактерий с потерей биосинтетических генов в водных экосистемах

Объектом исследования являлись общие колиформные бактерии, выделенные из поверхностных водных объектов Рязанской области. Целью данного научного исследования является оценка встречаемости вариантов с потерей биосинтеческих генов (ауксотрофов) среди общих колиформных бактерий (ОКБ) в сапрофитической стадии существования.
Материалами данной работы послужили теоретические исследования по изучению ауксотрофности микроорганизмов, а также собственные экспериментальные исследования.
В результате исследования было получено 54 штаммов ауксотрофных вариантов ОКБ. Планируется провести их видотипирование, а также определить по какому фактору роста они ауксотрофны.

Целью данного научного исследования является оценка встречаемости вариантов с потерей биосинтеческих генов (ауксотрофов) среди общих колиформных бактерий (ОКБ) в сапрофитической стадии существования.
Задачи:
• отобрать пробы воды из поверхностных водных объектов Рязанской области, отличающихся типом и интенсивностью антропогенной нагрузки;
• выделить изоляты общих колиформных бактерий из отобранных проб;
• провести селекцию эшерихий по потребности в факторах роста (аминокислотах) и выделить ауксотрофов;
• создать коллекцию ауксотрофных вариантов эшерихий;
• провести статистическую обработку полученных результатов.

Потеря биосинтетических генов является причиной развития ауксотрофности (потребности в наличии факторов роста в среде обитания).  Если про ауксотрофность бактерий, живущих в средах богатых питательными веществами (патогены, эндосимбионты, молочнокислые бактерии), известно давно и этот феномен широко изучен, то про потребность в факторах роста сапрофитных микроорганизмов, в частности колиформных бактерий, накоплен лишь незначительный материал. Вопрос о способности данных бактерий выживать во внеорганизменных средах остается открытым. Проведение анализа различных водных объектов Рязанской области на количественное содержание ауксотрофов дает понимание зависимости антропогенного влияния на присутствие в среде ауксотрофов.

Материалы исследований: 

Проведено изучение количества ауксотрофных вариантов штаммов ОКБ, выделенных из 4 водных объектов Рязанской области.Отбор проб воды из поверхностных водных объектов был проведен в 2015-2016г. Пробы из реки Листвянка были отобраны дважды, водозабор происходил на разных участках реки. Так же были взяты пробы воды реки Трубеж и озера Белое.  

Методы исследования:

1. отбор проб воды из поверхностных водных объектов в соответствии с ГОСТ  Р 53415–2009.
2. выделение изолятов общих колиформных бактерий методом мембранной фильтрации на среде Эндо.
3. селекция ауксотрофных вариантов по неспособности к росту на минимальной среде (по Clowes, Hayes, 1968).
4. статистическая обработка результатов.

 

Инкубация штаммов

Выделенные штаммы инкубировались при температуре +37°C и поддерживались на МПА (ГОСТ 13805-76 «Пептон сухой ферментативный для бактериологических целей. Технические условия (с Изменениями N 1, 2)»).

Идентификация ауксотрофов

Идентификация ауксотрофов проводили по неспособности к росту на минимальном агаре. В работе использовали минимальный агар следующего состава: 300мл 2-% водяного агара, 100мл солевого концентрата (NH4Cl - 20 г, NH4NO3- 4г, Na2SO4- 8г, K2HPO4- 12г, KH2PO4 - 4г, MgSO4 × 7 H2O- 0,4г, дистиллированная вода - 1000 мл) и 4 мл 20%-го раствора глюкозы. 

2.3.6 Статистическая обработка данных

Для обработки результатов использовались общепринятые методы статистической обработки данных. В расчетах использованы критерий Стьюдента и критерий χ2 Пирсона.

Отбор проб воды был проведен из четырех водных объектов Рязанской области, отличающихся типом и интенсивностью антропогенной нагрузки: р. Листвянка (после впадения очищенных промышленных и хозяйственно-бытовых сточных вод), р. Трубеж (загрязненной стоками ливневой канализации г. Рязани), р. Ока и озера Белое (территория Национального парка «Мещерский» в районе д. Белозерое).

Встречаемость ОКБ в обследованных водных объектах составила от 25 до 9648 КОЕ/100 мл. Встречаемость ОКБ выше всего в реке Листвянка, что свидетельствует об интенсивном загрязнении данного водного объекта плохо очищенными коммунальными сточными водами. Были получены результаты встречаемости ауксотрофных бактерий в четырех водных объектах Рязанской области.  

  Доля ауксотрофов от общего числа колиформ в реке Трубеж до впадения ливневых стоков составила 6,25±6,1% . Число повторной встречаемости ауксотроф может варьироваться от 0,05% до 23,7%. Доля ауксотрофных бактерий после впадения ливневых стоков составила 12,5±8,5%  с доверительными границами для среднего числа ауксотрофов от 0,1% до 33,5%. 

    Доля ауксотрофов от общего числа колиформ в реке Листвянка, отобранных в 2016 году, составила 32,7%. Число повторной встречаемости ауксотроф может варьироваться от 19,9% до 46,8%. Доля ауксотрофных вариантов среди ОКБ в пробах, отобранных в 2011 г., составила 35,7% с доверительными границами для среднего числа ауксотрофов от 12,9% до 62,6%. В июне 2016 года были отобраны пробы в трех местах: до впадения сточных вод, после(пруд-отстойник), через 500 метров после отстойного пруда. Доля ауксотрофов составила соответственно: 4±3,9%; 16±7,3%; 12±6,4%.

 Доля встречаемости ауксотрофных вариантов в озере Белое составила 11,1, а число повторной встречаемости может варьироваться от 0,05 до 39,6. 

Доля встречаемости ауксотрофных вариантов в реке Ока составила 4% , а число повторной встречаемости может варьироваться от 0,05 до 14,9. 

Варианты с потерей биосинтеческих генов (ауксотрофов) среди общих колиформных бактерий (ОКБ) в сапрофитической стадии существования зарегистрированы с частотой от 4 до 20,2%.

Частота встречаемости ауксотрофных вариантов среди колиформных бактерий в водных экосистемах зависит от интенсивности поступления аллохтонного органического вещества

Создана коллекция из 54 штаммов ауксотрофных вариантов общих колиформных бактерий, которая в дальнейшем планируется использовать для создания штаммов-продуцентов аминокислот в качестве пробиотиков для моногастричных животных и птиц.

1. ГОСТ 31955.1-2013 (ISO 9308-1:2000) «Вода питьевая. Обнаружение и
2. учет общих колиформных бактерий. Часть 1. Метод мембранной фильтрации».М.: Стандартинформ, 2014. 21 с.
3. Государственный доклад о состоянии окружающей природной среды Рязанской области в 2003 году (Белая книга). Рязань. 336с.
4. Гусев М. В., Минеева Л. А. Микробиология: учебник для студ. биол. специальностей вузов/7-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2006 г. – 448 с.
5. Жуков-Вережников Н. Н., Пехов А. П. Генетика бактерий. М.: Медгиз, 1963.-458 с.
6. Ивантер Э.В., Коросов А.В. Введение в количественную биологию: учеб. пособие. Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2003. 73-76 с.
7. Клаус Р, Хейс У., Сборник методик по генетике микроорганизмов. Москва: Изд-во «Медицина», 1970

The object of the study were total coliform bacteria isolated from surface water bodies of the Ryazan region. The study 54 strains auxotrophic variants of coliforms has been obtained. The results obtained during the work, can be used for scientific studies on the genetics of microorganisms.