Регистрация / Вход
Прислать материал

Влияние сверхэкспрессии тескалцина на адипогенную и остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток человека

Сведения об участнике
ФИО
Колобынина Ксения Глебовна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Влияние сверхэкспрессии тескалцина на адипогенную и остеогенную дифференцировку мезенхимных стволовых клеток человека
Резюме
Тескалцин играет важную роль в пролиферации и дифференцировке отдельных клеточных типов, контролирует экспрессию факторов транскрипции семейства Ets через PMA-индуцированный ERK-сигнальный путь. Этот путь регулирует пролиферацию и дифференцировку остеобластов и мезенхимных стволовых клеток (МСК) в процессе остеогенной дифференцировки. Особое место в регенеративной медицине занимают исследование и применение стволовых клеток, выделенных из жировой ткани (МСК-ЖТ), поскольку они отличаются сравнительной доступностью и высоким пролиферативным потенциалом, отдельный интерес представляет остеогенный и адипогенный потенциал МСК-ЖТ.
Ключевые слова
тескалцин, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, рекомбинантные лентивирусы, остеогенная дифференцировка, адипогенная дифференцировка
Цели и задачи
Цель работы – оценить влияние сверхэкспрессии тескалцина на дифференцировку мезенхимных стволовых клеток из жировой ткани человека (МСК-ЖТ) в адипогенном и остеогенном направлениях.
Задачи:
Получить рекомбинантные лентивирусы, кодирующие кДНК или киРНК к мРНК гена тескалцина человека. Провести генетическую модификацию (трансдукцию) мезенхимных стволовых клеток полученными лентивирусами.
2) Провести оценку жизнеспособности мезенхимных стволовых клеток после генетической модификации и подтвердить эктопическую экспрессию гена тескалцина в МСК-ЖТ.
3) Провести дифференцировку генетически модифицированных МСК-ЖТ в остеогенном и адипогенном направлениях.
Введение

Открытый в 2001 году белок тескалцин, принадлежащий к семейству EF-hand Ca²⁺-связывающих белков, показал свое участие в самых разных процессах в организме: взаимодействие с Na⁺/H⁺-антипортом 1 типа, контроль экспрессии факторов транскрипции семейства Ets через PMA-индуцированный ERK-путь, участие в NF-κB сигнальном пути, также он является потенциальной онкомишенью, нейрональным маркером и ингибитором гипертрофии сердца. Кроме того, также было показано, что тескалцин вовлечен в процессы дифференцировки и пролиферации клеток, в том числе и мегакариоцитов [1]. Однако нет данных о влиянии эктопической экспрессии тескалцина на направление и интенсивность дифференцировки МСК-ЖТ, что интересно с точки зрения регенеративной медицины [2,3]. 

Методы и материалы

МСК-ЖТ человека были выделены с помощью ферментативной обработки 0, 2% раствором коллагеназы краба (159 ПЕ/мг). Иммунофенотипирование МСК-ЖТ проводили с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания специфичными антителами к различным CD-маркерам. МСК-ЖТ со сверхэкспрессией или нокдауном гена тескалцина были получены путем их генетической модификации с использованием рекомбинантных лентивирусов, которые были получены по стандартной методике путем ко-трансфекции векторной, оболочечной и упаковочной плазмидами клеток HEK293-FT. Плазмиды предоставлены профессором молекулярной и клеточной фармакологии Медицинской школы Университета Майами (США) Слепаком В.З. Жизнеспособность МСК-ЖТ после лентивирусной трансфекции определяли с помощью MTS-теста. Эктопическая экспрессия тескалцина была подтверждена в одном из образцов МСК-ЖТ с помощью ПЦР в реальном времени (RT-PCR), остальные образцы были исследованы в качестве контрольных. МСК-ЖТ поддерживали в среде для дифференцировки StemPro® Osteogenesis Differentiation Kit (Gibco) 18 дней для остеогенной дифференцировки, в среде StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit (Gibco™) 14 дней для адипогенной дифференцировки. Относительное количество клеток, начавших дифференцировку, определялось методом визуального подсчета. Результаты анализировали на инвертированном микроскопе AxyObserver.Z1 (Carl Zeiss) с использованием программного обеспечения AxyoVision Rel. 4.8.

Описание и обсуждение результатов

Из жировой ткани человека были выделены МСК, экспрессирующие поверхностные антигены, характерные для МСК человека: CD44, CD73, CD90, CD105 и CD166. С помощью генетической модификации были получены МСК-ЖТ со сверхэкспрессией тескалцина, подтверждена эктопическая экспрессия тескалцина, чего не наблюдалось в контроле. Жизнеспособность МСК-ЖТ после вирусной трансдукции почти не изменилась по сравнению с нативными линиями МСК-ЖТ человека. Была индуцирована дифференцировка полученных линий МСК-ЖТ с сверхэкспрессией тескалцина в адипогенном и остеогенном направлении, проведена их окраска с целью детекции клеток, вступивших на путь дифференцировки.  Окраска Oil Red O и реакция von Kossa используются для визуальной идентификации дифференцирующихся клеток, анализ образцов после окраски показал значительное увеличение интенсивности дифференцировки МСК-ЖТ со сверхэкспрессией тескалцина как в адипогенном, так и в остеогенном направлении по сравнению с контрольными клетками. В результате визуального подсчета было выявлено, что по сравнению с контролем большее количество МСК-ЖТ со сверхэкспрессией тескалцина начало накопление включений, сигнализирующих о начале пролиферации стволовых клеток в специализированные. Можно заключить, что тескалцин способен увеличивать пролиферативный потенциал МСК-ЖТ, что могло бы быть полезным в регенеративной медицине.

Выводы:

  1. Получены рекомбинантные лентивирусы, кодирующие кДНК или киРНК к мРНК гена тескалцина человека. Получены линии МСК-ЖТ со сверхэкспрессией и нокдауном гена тескалцина.
  2. Жизнеспособность МСК-ЖТ почти не изменилась после лентивирусной трансдукции. Подтверждена эктопическая экспрессия гена тескалцина в линии МСК-ЖТ Tescalcin-GFP.
  3. В культуре МСК-ЖТ со сверхэкспрессией тескалцина наблюдалась значительно большая интенсивность остеогенной и адипогенной дифференцировки.
Используемые источники
1. Levay K., Slepak V.Z. Tescalcin is an essential factor in megakaryocytic differentiation associated with Ets family gene expression // J Clin Invest. – 2007. – V.117. – P. 2672-2683.
2. Карпюк В.Б., Лаврешин П.М., Маркушин А.А. Сравнительная оценка жизнеспособности клеток аспирированной жировой ткани. Методологические аспекты липофилинга // Анналы пластической, реконструктивной и эстетической хирургии. – 2011. – №4. – С.83-85.
3. Кирик В.М., Бутенко Г.М. Стволовые клетки из жировой ткани: основные характеристики и перспективы клинического применения в регенеративной медицине (обзор литературы) // Журн. АМН України. – 2010. – Т.16. – №4. – С. 576–604.
Information about the project
Surname Name
Kolobynina Ksenia
Project title
Tescalcin overexpression affects osteogenic and adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells
Summary of the project
Tescalcin plays an important role in the proliferation and differentiation of certain cell types. It is involved in the regulation of expression of Ets family transcription factors through PMA-induced the ERK pathway. The pathway regulates the proliferation and osteogenic differentiation of osteoblasts and mesenchymal stem cells (MSC). Research and application of adipose-derived stem cells (hADSCs) is the main part of regenerative medicine, since the hADSCs are notable for their accessibility and high proliferative potential. Osteogenic and adipogenic potential of hADSCs is of special interest.
Keywords
mesenchymal stem cells, tescalcin protein, recombinant lentiviruses, osteogenic differentiation, adipogenic differentiation