Регистрация / Вход
Прислать материал

Термофильный бактериофаг Aeribacillus pallidus AP45: свойства, анализ генома, жизненный цикл

Сведения об участнике
ФИО
Боковая Ольга Васильевна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Термофильный бактериофаг Aeribacillus pallidus AP45: свойства, анализ генома, жизненный цикл
Резюме
Tермофильный бактериофаг AP45 и его бактерия-хозяин КЭМТК 656 были выделены из образцов почвы Долины Гейзеров на Камчатке.
Хозяин был классифицирован как вид Aeribacillus pallidus.
Бактериофаг AP45 был причислен к семейству Siphoviridae. Фаг термостабилен при 55-65ºС, жизнеспособен при 75-85ºС и продуцирует термостабильный белок-эндолизин.
Размер генома составил 51 т.н.п. Выявлено 73 ОРТ, из которых 40 кодируют белки с неизвестными функциями. Наибольшее сходство геномов (36%) было обнаружено с термофильным фагом D6E [GU568037]. Большинство ОРТ неструктурных белков фага АР45 сходны с ОРТ организмов семейства Bacillaceae.
Была обнаружена способность к лизогенному пути развития.
Ключевые слова
Термофильный бактериофаг, Камчатская экосистема, свойства, геном, жизненный цикл
Цели и задачи
Целью данной работы являлось исследование термофильного бактериофага AP45 и идентификация бактерии-хозяина, а также поиск термостабильных ферментов, кодируемых геномом бактериофага, для дальнейших исследований. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Видовая идентификация микроорганизма-хозяина КЭМТК 656.
2. Изучение биологических, физико-химических свойств бактериофага AP45 и исследование вирусных частиц методами электронной микроскопии.
3. Получение препарата нуклеиновой кислоты бактериофага AP45 и анализ его полногеномной последовательности, выявление последовательностей, кодирующих предполагаемые ферменты.
4. Исследование жизненного цикла бактериофага AP45.
Введение

Открытие бактериофагов положило основу развитию молекулярной биологии. Бактериофаги присутствуют повсеместно, и известно множество работ по исследованию и применению бактериофагов в медицине, биологии и других областях. Существование организмов возможно даже в средах с экстремальными условиями, однако точных представлений о работе ферментативных систем, процессах транскрипции, трансляции и наследования генома в такой среде на сегодняшний день нет. И для выяснения особенностей этих процессов необходимо собрать и обработать как можно больше данных по термофильным организмам, в особенности по бактериофагам, описание которых легче в силу их простой организации.

Методы и материалы

Идентификацию культуры-хозяина проводили по последовательности гена 16S рРНК. Для этого ген был амплифицирован и секвенирован. Верификация и филотипирование осуществляли с использованием программного обеспечения Vector NTI и MEGA соответственно [1].

Биологические и физико-химические свойства бактериофага AP45 изучали классическими микробиологическими методами. Фаг был причислен к семейству Siphoviridae на основании электронно-микроскопического исследования морфологии вириона. 

Выделение ДНК бактериофага исполняли по классической методике выделения фаговой ДНК с модификациями [2]. Полногеномное секвенирование проводили с помощью прибора MiSeq Benchtop, сборку последовательности осуществляли программой CLC Genomics Workbench v.6.0.1. Анализировали геном AP45 с помощью программного обеспечения Vector NTI. Затем осуществляли поиск аналогов предполагаемых белков с помощью алгоритма BLASTX, используя базу данных GenBank. 

Поиск сходных геномов бактериофагов проводили по базе данных Genbank алгоритмом Nucleotide BLAST. Идентичность последовательностей геномов бактериофагов посчитали с помощью программного обеспечения BioEdit и сравнение последовательностей реализовывали используя MAFFT [3,4]. 

Жизненный цикл исследовали используя известную методику индукции выхода профага из лизогенных клеток [5]. Идентичность бактериофага AP45 и индуцированного фага подтверждали амплификацией гена минорного капсидного белка бактериофага AP45. 

 

Описание и обсуждение результатов

Tермофильный бактериофаг AP45 и его термофильный микроорганизм-хозяин КЭМТК 656 были выделены из почвенных образцов Долины Гейзеров на Камчатке.

Культура-хозяин была идентифицирована как термофильная бактерия вида Aeribacillus pallidus методом филотипирования по последовательности гена 16S рРНК. При этом в исходной культуре присутствовали два штамма, которые сильно различались морфологически и по набору биохимических активностей.

При визуализации структуры вириона бактериофага методом электронной микроскопии бактериофаг AP45 был отнесен к семейству Siphoviridae.

Бактериофаг обладает следующими биологическими свойствами: на газоне чувствительной культуры продуцирует бляшки размером 0,5-1 мм и широкую зону лизиса за счет продукции растворимого белка-эндолизина, разрушающего клеточные стенки бактерий. Фаг термостабилен при 55-65º С, сохраняет жизнеспособность при температуре 75-85º С, чувствителен к хлороформу. Константы скорости адсорбции бактериофага на клетках штаммов отличаются и составляют K= 1,58х10-7± 0,01 мл/мин, K= 8,45х10-8± 0,15 мл/мин, соответственно.

Размер генома по данным полногеномного секвенирования составил 51606 н.п. Анализ полученной последовательности выявил 73 предполагаемых ОРТ. Геном содержит ОРТ, кодирующие белки рекомбинации и регуляции метаболизма ДНК, белки лизиса бактериальной клетки, структурные белки, а также 40 ОРТ, кодирующих белки с неизвестными функциями, которые, вероятно, имеют уникальные функции. Геном бактериофага не содержит ДНК- и РНК-полимераз, то есть для своего воспроизводства фаг использует бактериальные полимеразы. Наибольшее сходство (36%) среди геномных последовательностей бактериофагов было обнаружено с термофильным фагом D6E [GU568037] в кластере структурных белков. Большинство ОРТ неструктурных белков фага АР45 имеют сходство с ОРТ термофильных микроорганизмов, относящихся к семейству Bacillaceae, что свидетельствует о том, что имело место коэволюционное развитие бактерий-хозяев и бактериофагов.

Способность к лизогенному пути развития была предположена благодаря наличию нескольких белков рекомбинации и подтверждена индукцией выхода профага из клеток культуры 656. Литический путь развития бактериофага обусловлен наличием в геноме ОРТ, кодирующих белки-эндолизины, которые используются для выхода новых фаговых частиц из клетки.

Таким образом, впервые был охарактеризован бактериофаг, специфичный к термофильной бактерии Aeribacillus pallidus, выделенной из камчатского термофильного сообщества. Бактериофаг относится к умеренным термофилам. Фаг AP45 способен как к литическому, так и к лизогенному путям развития. Для последовательностей, кодируемых неструктурными ОРТ фага, не обнаружено аналогичных последовательностей бактериофагов в существующих базах данных.

Используемые источники
1. Hall B. G. Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA // Mol Biol Evol. ‒ 2013. ‒ T. 30, № 5. ‒ C. 1229-35.
2. Sambrook J, Russell D Molecular Bacteriophage λ and its vectors. Molecular Cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press – 2001, P. 187-303.
3. He J., Dai X., Zhao X. PLAN: a web platform for automating high-throughput BLAST searches and for managing and mining results // BMC Bioinformatics. ‒ 2007. ‒ T. 8. ‒ C. 53.
4. Katoh K., Kuma K., Toh H., Miyata T. MAFFT version 5: improvement in accuracy of multiple sequence alignment // Nucleic Acids Res. ‒ 2005. ‒ T. 33, № 2. ‒ C. 511-8.
5. Chen F., Wang K., Stewart J., Belas R. Induction of multiple prophages from a marine bacterium: a genomic approach // Appl Environ Microbiol. ‒ 2006. ‒ T. 72, № 7. ‒ C. 4995-5001.
Information about the project
Surname Name
Bokovaya Olga
Project title
Thermophilic bacteriophage Aeribacillus pallidus: properties, genome analysis, life cycle
Summary of the project
Thermophilic bacteriophage AP45 and its host-bacterium СEMTC 656 were isolated from soil samples of Valley of Geizers from Kamchatka.
The host was classified as species Aeribacillus pallidus.
Bacteriophage AP45 was identified as a member of the family Siphoviridae. Phage is thermostable at 55-65 º C and viable at 75-85 º C and produces termostable protein-endolysin.
Genome size is 51606 bp and it contains 73 ORFs, 40 of which encode proteins with unknown functions. The highest similarity (36%) among the genomic sequences of bacteriophages was founded in the cluster of structural proteins with thermophilic phage D6E [GU568037]. Most ORFs among non-structural proteins of phage АР45 were similar to ORFs of the family Bacillaceae organisms.
The ability to lysogenic development was discovered.
Keywords
Thermophilic bacteriophage, Kamchatka ecosystem, properties, gemome, life cycle