Регистрация / Вход
Прислать материал

Сравнение протекторной активности гепарина и антикоагулянта из Vaccínium myrtíllus

Сведения об участнике
ФИО
Буслаева Наталья Николаевна
Вуз
государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Фундаментальная медицина и физиология
Тема
Сравнение протекторной активности гепарина и антикоагулянта из Vaccínium myrtíllus
Резюме
Исследование биологического действия лекарственных кандидатов представляет существенную проблему. В частности, достаточно сложно провести комплексное исследование системы гемостаза и оценить влияние на свертывание крови новых антикоагулянтов. Нами исследовано состояние показателей гемостаза и состояние гемодинамики в присутствии нового антикоагулянта растительного происхождения при моделировании претромботического состояния у лабораторных животных и проведено сравнение его влияния с гепарином.
Ключевые слова
растительный антикоагулянт, гемостаз, моделирование тромбоза, гепарин
Цели и задачи
Цель:
Провести изучение изменений гемостаза, включая прижизненную визуализизацию состояния кровотока, у лабораторных животных при введении нового низкомолекулярного антикоагулянта растительного происхождения и сравнить его влияние с гепарином.

Задачи:
1. Получить экстракт листьев черники обыкновенной, содержащий антикоагулянт, и провести его очистку.
2. Изучить влияние полученного антикоагулянта на показатели плазмокоагуляционного гемостаза у лабораторных животных в сравнении с гепарином.
3. Изучить изменения гемодинамики и микроциркуляции у лабораторных животных при введении полученного антикоагулянта и гепарина.
Введение

Исследование биологического действия химических соединений создаваемых лабораторно или получаемых из природных объектов как лекарственных кандидатов, представляет существенную проблему. При этом количество исследуемых противосвертывающих средств велико, и не прослеживается тенденции к уменьшению поисковой активности. В лабораториях Тюменского ГМУ из ряда растений Западной Сибири выделены и частично охарактеризованы эффекторы с антикоагулянтной активностью. Существующие данные говорят об их достаточно высокой противосвертывающей активности, приемлемой продолжительности действия и низкой токсичности. Однако их влияние на гемостаз оценено только в «пробирочных» тестах, и требуется их дальнейшее изучение.

Методы и материалы

В работе использовались самцы крыс массой 200 ± 40 г. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности (директива Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкская декларация (1996)). Антикоагулянты вводили внутривенно. Для коагуляционных тестов отбирали кровь и получали цитратную плазму.

Влияние антикоагулянтов на гемодинамику при моделировании тромбоза оценивали на сосудах микроциркуляторного (артериолы и венулы 25-50 мкм) русла брыжейки тонкого кишечника (полупроводниковый лазер, 535 нм, 50 мВт) методом интравитальной микроскопии.

Результаты экспериментов сравнивали с контролем, вводя вместо антикоагулянтов изотонический хлорид натрия.

Антикоагулянт получали из листьев черники обыкновенной по разработанной в нашей лаборатории методике. Влияние экстракта и коммерческого гепарина на плазмокоагуляцию оценивали по изменению активированного частичного тромбопластинового времени, протромбинового времени. Также изучали влияние на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и деформируемость эритроцитов. Оценку показателей свертывания крови проводили на автоматическом коагулометре «Solar» (Беларусь), с использованием стандартных тест-систем. Агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью анализатора «Biola-LA 320» (Россия), и стандартных наборов для оценки агрегации тромбоцитов «Технология-Стандарт» (Россия). Статистическую значимость оценивали, используя U-критерий Манна-Уитни, значимыми считались отличия при значениях р<0,05.

Описание и обсуждение результатов

Тестирование полученного из листьев черники экстракта «in vitro» показало, что наиболее выраженно в присутствии экстракта тормозилось АЧТВ, что свидетельствует о преимущественном влиянии экстракта на внутренний путь плазмокоагуляционного каскада. Одновременно, анализируя полученные данные, определили, что для уверенного выявления антикоагулянтного действия экстракта необходимо создать его конечную концентрацию не менее 1 мг/мл.

После внутривенного введения экстракта крысам через 5, 30 и 90 мин отбирали кровь и получали бедную тромбоцитами плазму, используя её для оценки АЧТВ и АТ. В течение времени наблюдения выявлялось выраженное (i=0,17±0,003) торможение АЧТВ. Раствор гепарина разводили изотоническим раствором, подбираю концентрацию, дающую при внутривенном введении аналогичную эффективность торможения (i=0,17±0,02).

В контрольной группе для развития гемодинамических нарушений требовалось облучение лазером в течение 180 секунд. По завершении облучения наблюдали увеличение скорости кровотока, сопровождавшееся повышением его оптической плотности, через 30 секунд скорость кровотока замедлялась и увеличивалась зернистость потока, что сопровождалось вазодилятацией и выраженной миграцией лейкоцитов в зону повреждения. В дальнейшем наблюдается адгезия и агрегация форменных элементов с формированием пристеночного, а затем и облитерирующего тромба.

Для развития гемодинамических нарушений на фоне предварительного введения гепарина потребовалось увеличить время облучения до 360 секунд. Но в отличие от контрольной группы полной остановки кровотока не наблюдалось, а гемодинамика восстанавливалась через 15 минут после прекращения воздействия.

При предварительном введении животным исследуемого экстракта листьев черники продолжительность облучения, необходимая для нарушения гемодинамики, составила 300 секунд. В сравнении с контрольной группой существенно снизилась выраженность лейкоцитарных реакций, увеличилась длительность развития гемодинамических нарушений, снизилась скорость формирования тромбов, а остановка кровотока носила временный характер (реканализация сосудов происходила через 12-18 минут).

Таким образом, полученный из листьев черники экстракт обладает антикоагулянтной активностью, реализуемой на внутреннем пути плазмокоагуляции, а антикоагулянтное действие сохраняется при внутривенном введении лабораторным животным. Предварительное введение антикоагулянта увеличивает время воздействия, требуемого для развития тромбоза и сосудистых реакций при повреждении эндотелия лазером, а протекторная эффективность антикоагулянта сопоставима с гепарином.

Используемые источники
1 Русакова О.А. Растения флоры Сибири, как источники антикоагулянтов прямого действия // В сб.: Обмен веществ в норме и патологии. - Тюмень, 1992. - С. 84.
2 Probucol protects against hypochlorite induced endothelial dysfunction: identification of a novel pathway of probucol oxidation to a biologically active intermediate / P.K. Witting [et al.] // J. Biol.Chem. – 2005. – Vol. 280. – P. 15612-15618.
3 Diaz J. A., Hawley A. E., Alvarado C. M. et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava: a novel mouse model // Thromb Haemost. 2010. no. 104. P. 366 –375.
4 Kretz C. A., Vaezzadeh N., Gross P. L. Tissue factor and thrombosis models // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 2010. Vol. 30. № 5. P. 900–908.
5 Diaz J. A., Obi A. T., Myers D. D. Jr. et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012. Vol. 32. № 3. P. 556–562.
Information about the project
Surname Name
Buslaeva Natalia
Project title
Comparison of protective activity of heparin and extract of Vaccínium myrtíllus
Summary of the project
The study of the biological action of drug candidates is a significant problem. In particular, performing a comprehensive research of hemostatic system and estimate the effects on blood clotting of new anticoagulants are diffcult. In this work, we study hemostasis and hemodynamics during the testing of plant anticoagulants in animal model of thrombosis and compare its effects with heparin.
Keywords
plant anticoagulant, hemostasis, modeling of thrombosis, heparin