Прислать материал
Сравнение протекторной активности гепарина и антикоагулянта из Vaccínium myrtíllus
Провести изучение изменений гемостаза, включая прижизненную визуализизацию состояния кровотока, у лабораторных животных при введении нового низкомолекулярного антикоагулянта растительного происхождения и сравнить его влияние с гепарином.
Задачи:
1. Получить экстракт листьев черники обыкновенной, содержащий антикоагулянт, и провести его очистку.
2. Изучить влияние полученного антикоагулянта на показатели плазмокоагуляционного гемостаза у лабораторных животных в сравнении с гепарином.
3. Изучить изменения гемодинамики и микроциркуляции у лабораторных животных при введении полученного антикоагулянта и гепарина.
Исследование биологического действия химических соединений создаваемых лабораторно или получаемых из природных объектов как лекарственных кандидатов, представляет существенную проблему. При этом количество исследуемых противосвертывающих средств велико, и не прослеживается тенденции к уменьшению поисковой активности. В лабораториях Тюменского ГМУ из ряда растений Западной Сибири выделены и частично охарактеризованы эффекторы с антикоагулянтной активностью. Существующие данные говорят об их достаточно высокой противосвертывающей активности, приемлемой продолжительности действия и низкой токсичности. Однако их влияние на гемостаз оценено только в «пробирочных» тестах, и требуется их дальнейшее изучение.
В работе использовались самцы крыс массой 200 ± 40 г. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности (директива Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкская декларация (1996)). Антикоагулянты вводили внутривенно. Для коагуляционных тестов отбирали кровь и получали цитратную плазму.
Влияние антикоагулянтов на гемодинамику при моделировании тромбоза оценивали на сосудах микроциркуляторного (артериолы и венулы 25-50 мкм) русла брыжейки тонкого кишечника (полупроводниковый лазер, 535 нм, 50 мВт) методом интравитальной микроскопии.
Результаты экспериментов сравнивали с контролем, вводя вместо антикоагулянтов изотонический хлорид натрия.
Антикоагулянт получали из листьев черники обыкновенной по разработанной в нашей лаборатории методике. Влияние экстракта и коммерческого гепарина на плазмокоагуляцию оценивали по изменению активированного частичного тромбопластинового времени, протромбинового времени. Также изучали влияние на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов и деформируемость эритроцитов. Оценку показателей свертывания крови проводили на автоматическом коагулометре «Solar» (Беларусь), с использованием стандартных тест-систем. Агрегацию тромбоцитов исследовали с помощью анализатора «Biola-LA 320» (Россия), и стандартных наборов для оценки агрегации тромбоцитов «Технология-Стандарт» (Россия). Статистическую значимость оценивали, используя U-критерий Манна-Уитни, значимыми считались отличия при значениях р<0,05.
Тестирование полученного из листьев черники экстракта «in vitro» показало, что наиболее выраженно в присутствии экстракта тормозилось АЧТВ, что свидетельствует о преимущественном влиянии экстракта на внутренний путь плазмокоагуляционного каскада. Одновременно, анализируя полученные данные, определили, что для уверенного выявления антикоагулянтного действия экстракта необходимо создать его конечную концентрацию не менее 1 мг/мл.
После внутривенного введения экстракта крысам через 5, 30 и 90 мин отбирали кровь и получали бедную тромбоцитами плазму, используя её для оценки АЧТВ и АТ. В течение времени наблюдения выявлялось выраженное (i=0,17±0,003) торможение АЧТВ. Раствор гепарина разводили изотоническим раствором, подбираю концентрацию, дающую при внутривенном введении аналогичную эффективность торможения (i=0,17±0,02).
В контрольной группе для развития гемодинамических нарушений требовалось облучение лазером в течение 180 секунд. По завершении облучения наблюдали увеличение скорости кровотока, сопровождавшееся повышением его оптической плотности, через 30 секунд скорость кровотока замедлялась и увеличивалась зернистость потока, что сопровождалось вазодилятацией и выраженной миграцией лейкоцитов в зону повреждения. В дальнейшем наблюдается адгезия и агрегация форменных элементов с формированием пристеночного, а затем и облитерирующего тромба.
Для развития гемодинамических нарушений на фоне предварительного введения гепарина потребовалось увеличить время облучения до 360 секунд. Но в отличие от контрольной группы полной остановки кровотока не наблюдалось, а гемодинамика восстанавливалась через 15 минут после прекращения воздействия.
При предварительном введении животным исследуемого экстракта листьев черники продолжительность облучения, необходимая для нарушения гемодинамики, составила 300 секунд. В сравнении с контрольной группой существенно снизилась выраженность лейкоцитарных реакций, увеличилась длительность развития гемодинамических нарушений, снизилась скорость формирования тромбов, а остановка кровотока носила временный характер (реканализация сосудов происходила через 12-18 минут).
Таким образом, полученный из листьев черники экстракт обладает антикоагулянтной активностью, реализуемой на внутреннем пути плазмокоагуляции, а антикоагулянтное действие сохраняется при внутривенном введении лабораторным животным. Предварительное введение антикоагулянта увеличивает время воздействия, требуемого для развития тромбоза и сосудистых реакций при повреждении эндотелия лазером, а протекторная эффективность антикоагулянта сопоставима с гепарином.
2 Probucol protects against hypochlorite induced endothelial dysfunction: identification of a novel pathway of probucol oxidation to a biologically active intermediate / P.K. Witting [et al.] // J. Biol.Chem. – 2005. – Vol. 280. – P. 15612-15618.
3 Diaz J. A., Hawley A. E., Alvarado C. M. et al. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava: a novel mouse model // Thromb Haemost. 2010. no. 104. P. 366 –375.
4 Kretz C. A., Vaezzadeh N., Gross P. L. Tissue factor and thrombosis models // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 2010. Vol. 30. № 5. P. 900–908.
5 Diaz J. A., Obi A. T., Myers D. D. Jr. et al. Critical review of mouse models of venous thrombosis // Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2012. Vol. 32. № 3. P. 556–562.