Регистрация / Вход
Прислать материал

Липофильные siРНК, содержащие биодеградируемые связи

Сведения об участнике
ФИО
Можайцев Евгений Сергеевич
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Химия и химические технологии
Раздел области наук
Химия высокомолекулярных соединений. Нефтехимия. Катализ
Тема
Липофильные siРНК, содержащие биодеградируемые связи
Резюме
Нерешенной до конца проблемой использования функциональных нуклеиновых кислот (ФНК - ДНК, РНК и их аналоги) для регуляции экспрессии определенных генов является низкая эффективность их доставки в клетку. Разработан новый подход к синтезу «на твердой фазе» гидразонсодержащих 5'-конъюгатов олигонуклеотидов с группами-транспортерами. Данный подход является общим и может быть использован для синтеза конъюгатов ФНК с группировками различного типа действия. Стабильность полученных конъюгатов при рН, близких к нейтральным, и их лабильность в более кислых условиях, соответствующих условиям внутри эндосом, позволяют надеяться на высокий биологический эффект такого типа конъюгатов.
Ключевые слова
siРНК, гидразонсодержащие конъюгаты олигонуклеотидов, холестерин, α-токоферол, биодеградируемые связи
Цели и задачи
Целью данной работы являлась разработка нового подхода к синтезу «на твердой фазе» гидразонсодержащих 5'-липофильных конъюгатов НК и исследование их стабильности при различных значениях pH. В качестве липофильных молекул-транспортеров нами были выбраны холестерин и α-токоферол. В качестве представителя функциональных НК была выбрана малая интерферирующая РНК, направленная к участку 557-577 мРНК гена множественной лекарственной устойчивости MDR [1]. Наличие 5’-липофильного остатка, введенного в ее сенс-цепь, не влияет на биологическую активность анти-MDR1 siРНК [2]. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд задач:
1) cинтезировать две серии исходных ненуклеотидных синтонов на основе холестерина и α-токоферола;
2) разработать условия твердофазного синтеза конъюгатов олигонуклеотидов на примере модельного гидразонсодержащего 5'-холестеринового конъюгата гептатимидилата dT7;
3) с использованием разработанного подхода синтезировать новые гидразонсодержащие 5'-липофильные конъюгаты сенс-цепи анти-MDR1 siРНК с холестерином и α-токоферолом;
4) исследовать стабильность полученных гидразонсодержащих 5'-липофильных конъюгатов сенс-цепи анти-MDR1 siРНК при различных значениях pH.
Введение

Использование функциональных нуклеиновых кислот (ФНК - каталитические НК, аптамеры, siРНК и др.) и конструкций на их основе в качестве перспективных высокоселективных инструментов молекулярно-биологических исследований, а также потенциальных терапевтических средств в настоящее время вызывает огромный интерес. Одним из основных препятствий на пути их практического применения является низкая эффективность их проникновения в клетки-мишени. Конъюгирование ФНК с различными молекулами-транспортерами (напр., липофильными соединения) посредством биодеградируемых связей позволяет улучшить фармакокинетические свойства ФНК и повысить эффективность их биологического действия.

Методы и материалы

Методика синтеза гидразидного производного холестерина (IV) разработана совместно с Довыденко И.С. [3], с ее использованием синтезировано гидразидное производное α-токоферола (VIII). Контроль за ходом реакций образования целевых гидразидов (IV, VIII) и их предшественников (II, III, VI, VII) проводили методом ТСХ. Доказательство строения полученных ненуклеотидных синтонов проводили методами 1H-ЯМР-спектрометрии и MALDI-TOF-спектроскопии. Синтез олигонуклеотидов и их 5’-альдегидсодержащих производных вели на синтезаторе ASM-800 («Биоссет», Россия) твердофазным фосфитамидным методом по протоколу [4], оптимизированному для данного прибора. Деблокирование и удаление немодифицированных олигонуклеотидов с полимерного носителя проводили по стандартным методикам [5]. Разработку методики синтеза «на твердой фазе» гидразонсодержащих 5’-липофильных конъюгатов олигонуклеотидов и подбор условий их деблокирования проводили на модельном 5’-альдегидмодифицированном олигодезоксирибонуклеотиде dT7. В подобранных условиях проводили синтез гидразонсодержащих 5’-липофильных конъюгатов сенс-цепи анти-MDR1 siРНК (IX, X). Полученные конъюгаты выделяли препаративным гель-электрофорезом, их стабильность исследовали в фосфатных буферах в диапазоне значений рН 4.8-7.8. Для получения значений молекулярных масс олигонуклеотидов и их липофильных конъюгатов был использован метод масс-спектрометрии с электроспрей-ионизацией.

Описание и обсуждение результатов

Предложенный нами подход к синтезу «на твердой фазе» гидразонсодержащих 5’-липофильных конъюгатов олигонуклеотидов имеет ряд преимуществ перед вариантом синтеза «в растворе», разработанным ранее в нашей лаборатории [3] - он позволяет варьировать в широких пределах соотношение водно-органической фазы, добиваясь оптимального растворения компонент реакции; легко отделяться от непрореагировавших соединений на всех стадиях, поскольку в процессе синтеза конъюгат все время присоединен к твердой фазе; проводить масштабирование синтеза. Подход предполагает автоматический фосфитамидный синтез соответствующих олигонуклеотидов, их 5'-альдегидную модификацию и дальнейшее взаимодействие с гидразидными производными липофильных соединений.

При синтезе целевых гидразидов на первом этапе было синтезировано бис-силильное производное аминокапроновой кислоты, взаимодействие которого с активированным производным холестерина (I) или α-токоферола (V) приводило к получению соединений (II) и (VI). Далее получали соответствующие метиловые эфиры (III) и (VII), которые вводили в реакцию с избытком гидразингидрата с образованием целевых гидразидов (IV) и (VIII) (рис. 1).

Подбор условий синтеза гидразонсодержащих конъюгатов олигонуклеотидов «на твердой фазе» проводили на модельном гептатимидилате dT7, который вводили в реакцию с гидразидом (IV) в системе растворителей диоксан:вода в различных соотношениях и при различной концентрации натрий ацетатного буфера (рН 5.2), параллельно были подобраны «мягкие» условия деблокирования гидразонсодержащих конъюгатов олигонуклеотидов.

В подобранных условиях был осуществлен синтез гидразонсодержащих конъюгатов  сенс-цепи анти-MDR1 siРНК с остатками холестерина и α-токоферола (IX, X) (рис. 2). Стабильность полученных конъюгатов исследовали в фосфатных буферах со значениями рН в диапазоне 4.8-7.8 (рис. 3,4).

Выводы

  1. Впервые синтезированы гидразид N-(холестерилоксикарбонил)-6-аминогексановой кислоты и гидразид 6-[2,5,7,6-тетраметил-2-(4',8',12'-триметилтридецил)-хроман-6-илоксикарбонил]-аминогексановой кислоты, а также их предшественники.
  2. Разработан твердофазный метод синтеза гидразонсодержащих 5'-липофильных конъюгатов смысловой цепи анти-MDR1 siРНК:
  1. разработаны условия твердофазного синтеза конъюгатов олигонуклеотидов на примере модельного гидразонсодержащего 5'-холестеринового конъюгата dT7;
  2. с использованием разработанного подхода синтезированы новые гидразонсодержащие 5'-липофильные конъюгаты сенс-цепи анти-MDR1 siРНК, содержащие остатки холестерина и α-токоферола.
  1. При исследована стабильности гидразонсодержащих 5'-липофильных конъюгатов сенс-цепи анти-MDR1 siРНК показано, что при pH 6.8 - 7.8 конъюгаты стабильны, при рН 5.8 за 24 часа происходит их гидролиз на 46-50%, а при pH 4.8 за 24 часа конъюгаты подвергаются гидролизу на 65%-70%. 
Используемые источники
1. Volkov A.A., et al. Selective protection of nuclease-sensitive sites in siRNA prolongs silencing effect // Oligonucleotides. 2009. V. 19. P. 191.
2. Petrova N.S., et al. Carrier-free cellular uptake and the gene-silencing activity of the lipophilic siRNAs is strongly affected by the length of the linker between siRNA and lipophilic group // Nucleic Acids Res. 2012. V. 40. P. 2330.
3. Dovydenko I., et al. Method of carrier-free delivery of therapeutic RNA importable into human mitochondria: Lipophilic conjugates with cleavable bonds // Biomaterials. 2016. V. 76. P. 408.
4. Bellon L. Oligoribonucleotides with 2'-O-(tert-butyldimethylsilyl)groups // Current Protocols in Nucl. Acid Chem. / Eds. S. L. Beaucage, D. E. Bergstrom, G. D. Glick, R. A. Jones. New York: John Wiley & Sons, Inc., 2000. Unit 3.6.
5. http://www.glenresearch.com//Technical/Deprotection.pdf
Information about the project
Surname Name
Mozhaytsev Evgeny
Project title
Lipophilic siRNA containing biodegradable bonds
Summary of the project
One of major unsolved problem in gene therapy with the use of functional nucleic acids (FNA, i.e. DNA, RNA and their analogs) is a low efficiency of their delivery in cells. A new approach for the synthesis of 5'-conjugates of oligonucleotides with transporter groups and containing hydrazon linkage was developed. The approach is universal and could be used for the synthesis of 5'-conjugates of FNA with different functional groups. The stability of these conjugates at about neutral pH, and their lability in more acidic conditions corresponding to the conditions within the endosome, makes them promising tool of gene therapy.
Keywords
siRNA, oligonucleotide conjugates containing hydrazone linkages, cholesterol, α-tocopherol, biodegradable bonds.