5-алкил/арилоксиметил-1,2,4-триазол-3-карбоксамиды - субстраты рекомбинантных нуклеозидфосфорилаз.

Разработан универсальный способ синтеза эфиров 5-замещенных 1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот, который позволяет получать как ациклические, так и гетероциклические производные, получена серия эфиров 1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот с различными 5-алкил/арилоксиметильными заместителями и соответствующих амидов. Производные 1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты были получены в препаративных количествах, их структура была охарактеризована методами физико-химического анализа. Были проведены исследования субстратной специфичности НФ по отношению к синтезированным соединениям, обнаружены новые субстраты НФ, получены новые аналоги нуклеозидов.

Целью работы стал синтез ряда 5-алкокси/арилоксиметил замещённых 1,2,4-триазол-3-карбоксамидов – потенциальных субстратов НФ и изучение их способности к трансгликозилированию.
Для реализации поставленной цели – синтеза модифицированных гетероциклических оснований нам надо было решить следующие задачи:
1. Разработать синтетическую схему на основе единого предшественника позволяющую получить этиловые эфиры 5-замещенных 1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот;
2. Получить исходные соединения для синтеза 5-алкил/арилоксиметил производных 1,2,4-триазол-3-карбоксамида;
3. Синтезировать и выделить новые 5-алкил/арилоксиметил-1,2,4-триазол-3-карбоксамиды, охарактеризовав их методами физико-химического анализа;
4. Изучить субстратную специфичность НФ по отношению к синтезированным соединениям.

Вследствие относительно низкой субстратной специфичности, нуклеозидфосфорилазы (НФ) применяют в синтезе аналогов нуклеозидов [1]. Они катализируют реакцию трансгликозилирования.

Полученные ранее данные указывали на то, что 1,2,4-триазол-3-карбоксамиды (ТКА) с объемным заместителем в 5-ом положении  не могут быть субстратами этих ферментов  из-за стерических затруднений в активном центре фермента [2].

В ходе исследований последнего времени нами был установлен неожиданный факт – аналоги ТКА с достаточно объёмным алкоксиметильным заместителем в 5-ом положении оказались субстратами НФ. Это открыло новое направление в исследовании структуры активного центра НФ и поиске новых фармакологически активных аналогов нуклеозидов.

Спектры ¹Н и ¹³С-ЯМР были зарегистрированы на приборе DPX 300 (Bruker, Германия) с резонансной частотой ¹H=300 МГц, ¹³C=75 МГц. Химические сдвиги приведены в миллионных долях, константы спин-спинового взаимодействия J - в герцах.

Протекание реакций контролировали с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках «Sorbfil» (РФ). Элюент: хлороформ-метанол 49:1. В качестве проявителя на хроматограммах применяли йод, растворы нингидрина и фосфорно-молибденовой кислоты.

В работе использовались растворители российского производства. Растворители при необходимости абсолютизировали стандартными методами. Вос-гидразин, н-дециловый спирт, изопропиловый спирт, этоксиуксусная кислота, бутоксиуксусная кислота и метоксиэтоксиуксусная кислота отечественного производства.

 

Ранее в нашей лаборатории  был разработан способ синтеза эфиров 5-замещенных 1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот (ТКК) [3]. Мы модифицировали этот метод, проводя циклизацию единого предшественника - β-N-Вос-оксаламидразона (1)  под действием хлорангидридов соответствующих карбоновых кислот (2а-j) при нагревании в пиридине.

В результате применения этого подхода нами была получена серия эфиров ТКК с различными 5-оксиметильными заместителями (3а-j). Получали эфиры (3а-j) обработкой β-N-Вос-оксаламидразона (1)  хлорангидридами карбоновых кислот (2а-j) при кипении в пиридине в течение 24 часов (схеме1). Хлорангидриды были взяты в избытке (2,15 экв.), так как использование меньшего количества эквивалентов снижает выход продукта.

Для изучения субстратной специфичности, из эфиров (3а-j) необходимо было получить карбоксамиды (4а-j). Это было достигнуто обработкой соединений (3а-j) метанольным раствором аммиака. Полученная серия соединений (4a-j) была охарактеризована и передана на биологические исследования в лабораторию биотехнологии ИБХ РАН.

Стандартная методика получения хлорангидридов (2а-j)

К  раствору 5-алкил/арилоксиметилуксусной кислоты в абсолютном хлористом метилене охлажденному до 0 ⁰C при перемешивании добавляли по каплям 2,5 эквивалента оксалилхлорида, перемешивание продолжали в течение 12 часов при комнатной температуре. По окончании реакции, избыток оксалилхлорида осторожно удаляли на вакуумном роторном испарителе при комнатной температуре. Полученный продукт использовали в дальнейших реакциях без дополнительной очистки.

Стандартная методика получения этиловых эфиров 5-замещынных 1,2,4-триазол-3-карбоновых кислот (3а-j)

К суспензии β-N-Вос-оксаламидразона в абсолютном пиридине,  при охлаждении до 0 ⁰C прибавляли по каплям  2,15 эквивалента соединения (2а-j). Реакционную массу кипятили в течение 20 часов. Затем удаляли растворитель на вакуумном роторном испарителе, добавляли к остатку 5 мл 3% раствора НСl и экстрагировали этилацетатом 3 раза по 15 мл. Органическую фазу сушили над Na₂SO₄, растворитель удаляли на вакуумном роторном испарителе. Продукт выделяли с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюент хлороформ - метанол ( с  градиентом метанола от 0 до 7 %).

Стандартная методика получения 5-замещенных 1,2,4-триазол-3-карбоксамидов (4a-j)

Этиловый эфир 5-алкил/арилоксиметил-1,2,4-триазол-3-карбоновой кислоты растворяли в 50-и кратном избытке 10М метанольного раствора аммиака. Кипятили в течение 2-х дней с обратным холодильником, добавляя каждые 12 часов 5-и кратный избыток 14М водного раствора аммиака. По окончании реакции растворитель удаляли на вакуумном роторном испарителе. Продукт суспензировали в безводном ацетоне, растворитель удаляли фильтрованием, осадок сушили в эксикаторе при пониженном давлении над NaOH (12 часов). 

1.A. Bzowska / E. Kulikowska, D. Shugar //Pharmacology & Therapeutics. – 2000. – V. 88. P. – 349–425.
2.1. И.Д. Константинова, М.В. Чудинов, И.В. Фатеев, А.В. Матвеев, Н.И. Журило, В.И. Швец, А.И. Мирошников // Биоорганическая химия, 2013, Т.39 №1, С.61-80.
3.M. V.Chudinov, A. V.Matveev, N. I. Zhurilo, A. N. Prutkov, V. I. Shvets, J Het Chem, 2015, 52, p.1273.

The universal synthetical method for the 5-substituted 1,2,4-triazole-3-carboxylic acid esters has been developed. This method makes it possible to obtain both acyclic and heterocyclic derivatives. A number of various 5-alkyl/aryloxyalkyl substituted 1,2,4-triazole-3-carboxylic acid esters with the corresponding amides was obtained in preparative amounts and their structures was proved applying NMR and MS analysis. The new nucleoside phosphorylase substrates was found and the new nucleoside analogues were received.