«Оценка чувствительности живых систем к наночастицам серебра»

Наночастицы серебра (НЧС) были синтезированы путем восстановления элементарного серебра из раствора нитрата серебра. Образцы НЧС были охарактеризованы спектрофотометрическими, электронно-микроскопическими и дифракционными методами. Токсичность полученных НЧС исследовали на бактериях, вирусах, дрожжах, на культивируемых клеточных линиях человека, млекопитающих и моллюсках. НЧС имели высокую противомикробную активностью и низкую токсичность в клетках эукариот. Беспозвоночные эукариоты проявляют большую чувствительность к НЧС, чем млекопитающие.

Цель работы состояла в оценке токсичности наночастиц серебра, синтезированных химическим методом, по отношению к организмам разных филогенетических групп.
Задачей данной работы являлась исследование токсического действия наночастиц серебра на выживаемость бактерий E. coli, дрожжей S. cerevisiae, сохранения вирулентности бактериофага 80, культивируемых клеток человека, а также моллюсков, крыс и мышей.

Интерес к наночастицам серебра (НЧС) постоянно растет. Они применяются в самых разных областях медицинской и технической деятельности человека [1-5]. Привлекательность НЧС обусловлена их высокой антимикробной активностью, низкой токсичностью в отношении эукариот. Таким образом, существует спрос на НЧС с эффективными антибактериальными свойствами и одновременно минимизированным влиянием на высших эукариотов. Теории, позволяющей синтезировать НЧС с заданными биологическим свойствами, не существует. Поэтому поиск НЧС с подходящими свойствами идет эмпирически. Представленное исследование относится к этому направлению. Оно включает синтез и характеристику НЧС, оценку их антибактериальных свойств и изучение влияния на млекопитающих.

Биологические объекты: бактериофаг 80, штамм K802 E. coli, дрожжи S. cerevisiae, клетки человека HepG2 и НЕК293, улитки P. corneus, мыши C57BL.

Методы.

НЧС получали восстановлением серебра из раствора AgNO₃. Для защиты НЧС, использовали β-циклодекстрин, в качестве редуцирующих агентов – растительный полифенол. НЧС характеризовали спектрофотометрическими, электронно-микроскопическими и дифракционными методами.

Клетки E.coli выращивали в питательной среде, основанной на бычьем сывороточном гидролизате при 37 °C и обрабатывали 10 мкM или 100 мкM НЧС. Дрожжи росли сутки в дрожжевой среде, суспензию 10⁷ клеток/мл 10, или 100, мкМ НЧС обрабатывали клетки и через различные интервалы времени НЧС отмывали, а клетки рассевали на агарозный газон в последовательных 10-кратных разведениях. Через сутки определяли количество и размер выросших колоний, CFU.

Клетки HepG2 и HEK293 росли на стандартной среде. НЧС добавляли в различных концентрациях на 24 ч при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. Жизнеспособность клеток оценивали МТТ-тестом [6].

Улитки P. Corneus содержали в воде с НЧС в течение 24 ч. Фенолоксидазную активность гемолимфы измеряли в присутствии L-DOPA [7].

Мыши получали НЧС в/б (10 мкг/г), или интраназально (1.5 мкг/г) в течение 4 дней. Оксидазную активность в сыворотке крови определяли окрашиванием гелей о-дианизидином [8].

Концентрацию серебра в тканях измеряли с помощью беспламенной атомно-абсорбционной спектрометрии (FAAS). Данные выражены как "среднее значение ± S.D.”

Физико-химические свойства НЧС представлены на Рис.1. Спектр поглощения полученного раствора имеет широкий пик с максимумом поглощения 400 нм, с границами между 350 и 420 нм. Это указывает на то, что поглощающий материал является кристаллами серебра, а в растворе отсутствуют ионы серебра. Эти данные поддерживают результаты дифрактометрии (Рис.2).

Рисунок 1 - Спектр поглощения НЧС (UV/vis абсорбционная спектроскопия)

Рисунок 2 - Рентгеновская дифрактометрия образца НЧС.

ПЭМ показал, что НЧС имели сферическую форму с диаметром ~15 нм (Рис.3).

Рисунок 3 -­ Микрофотография НЧС в ПЭМ

Результаты тестирования биологической активности НЧС суммированы на Рис. 2. Они показывают, что НЧС подавляли рост всех использованных в исследовании биологических объектов в концентрационно-временной зависимости. Колониеобразующая активность E. coli при их обработке 100 мкM НЧС уже через 2 часа практически утрачивают способность к размножению, а при обработке 10 мкM НЧС в течение суток падает не менее, чем на 6 порядков (Рис.4А). В тех же условиях жизнеспособность дрожжевых клеток снижается на 1.5 порядка через 2 часа обработки и не меняется в течение суток (Рис.4В). Устойчивость эукариотических клеток к более высоким концентрациям НЧС можно объяснить более совершенной системой транспорта и экскреции меди и серебра. Обработка фагов 100 мкM НЧС 24 ч снижает их вирулентность примерно на 2 порядка (Рис.4С). Для культивируемых клеток человека полулетальной дозой является примерно 200 мкM НЧС (Рис.4D).

Действие НЧС было проверено и на мышах и на крысах, так как модели выращиваемых опухолей человека разработаны на мышах, а модели нейродегенеративных болезней человека, ассоциированных с нарушением метаболизма меди, - на крысах. На рис. 5 приведены данные распределения серебра в органах крыс через сутки после 4-кратного ежесуточного в/б (кумулятивная доза 400 мкг/кг массы тела) и интраназального (кумулятивная доза 160 мкг/кг массы тела) введения НЧС. Видно, что доля обнаруживаемого серебра зависит от способа введения частиц. При в/б введении основная часть серебра обнаруживается в печени, при и/н – в легких и в мозгу (Рис.5А и 5В).

У мышей после в/б введении НЧС оксидазная активность крови падает в 9 раз (Рис.5С). Это однозначно свидетельствует о том, что серебро наночастиц включается в метаболизм меди, поступает в печень, достигает аппарата Гольджи и встраивается в секретируемый ЦП, нарушая его активность. Токсического эффекта (потеря веса, нарушение пищеварения, поведенческие изменения) НЧС у млекопитающих не вызывали.

 

Для сравнения токсическая активность НЧС была проверена на моллюске P. corneus, распространенном в РФ и являющемся промежуточным хозяином ряда трематод, опасных и для человека. Группы по 5 особей в течение суток содержали в воде с 5, 10, 20, 50 и 100 мкM НЧС (Рис. 5D). У животных, содержавшихся с 50 и 100 мкM НЧС, наблюдали отек мантии и снижение фенолоксидазной активности в 2 раза.

1) Franci G. et al. //Molecules. – 2015. – Т. 20. – №. 5. – С. 8856-8874.
2) Couvreur P., Vauthier C. //Pharmaceutical research. – 2006. – Т. 23. – №. 7. – С. 1417-1450.
3) Ge L. et al. //International journal of nanomedicine. – 2014. – Т. 9. – С. 2399.
4) Moghimi S. M., Hunter A. C., Murray J. C. //The FASEB journal. – 2005. – Т. 19. – №. 3. – С. 311-330.
5) Couvreur P., Vauthier C. //Pharmaceutical research. – 2006. – Т. 23. – №. 7. – С. 1417-1450.
6) Riss T. L., Moravec R. A., Niles A. L. //Mammalian Cell Viability: Methods and Protocols. – 2011. – С. 103-114
8) Zatulovskaia Y. A., Ilyechova E. Y., Puchkova L. V. //PloS one. – 2015. – Т. 10. – №. 10. – С. e0140797
7) Laughton A. M., Boots M., Siva-Jothy M. T. //Journal of insect physiology. – 2011. – Т. 57. – №. 7. – С. 1023-1032.

The silver nanoparticles (SNP) were synthesized by the reduction of elemental silver from silver nitrate solution. The samples were characterized by spectrophotometric, electron microscopy and diffraction methods. Toxicity of the SNP was tested in bacteria, viruses, yeasts, cultured on human cell lines, mammals and mollusks. SNP had high antimicrobial activity and low toxicity in eukaryotes. It was found that more sensitive to invertebrates SNP than mammals.