Регистрация / Вход
Прислать материал

Роль системы тиоредоксина в дизрегуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы при действии модуляторов редокс- статуса

Сведения об участнике
ФИО
Егорова Мария Юрьевна
Вуз
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Фундаментальная медицина и физиология
Тема
Роль системы тиоредоксина в дизрегуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы при действии модуляторов редокс- статуса
Резюме
Абсолютно новым является направление исследования вклада процесса редокс-модуляции тиоредоксином в регуляторную активность различных белков клетки, в том числе циклинов и циклинзависимых киназ – модуляторов пролиферации. Данное направление представляется весьма перспективным для поиска молекулярных маркеров социально-значимых заболеваний, в том числе для изучения процессов опухолевой трансформации молочной железы, являющиеся ведущими в структуре онкологической заболеваемости у женщин в мире и России в частности.
Ключевые слова
редокс-статус клеток; тиоредоксин; аденокарцинома молочной железы; пролиферация
Цели и задачи
Цель исследования: оценить роль системы тиоредоксина в дизрегуляции пролиферации клеток аденокарциномы молочной железы линии МСF-7 при действии блокатора SH-групп белков – N-этилмалеимида и протектора SH-групп протеинов – 1,4-дитиоэритритола.
Задачи:
1. Определить содержание активных форм кислорода в интактной культуре клеток линии МСF-7 и при действии блокатора SH-групп N-этилмалеимида и протектора тиоловых групп 1,4-дитиоэритритола.
2. Оценить состояние системы тиоредоксина и содержание восстановленного и окисленного глутатиона в интактной культуре опухолевых клеток линии МСF-7 и при действии блокатора SH-групп N-этилмалеимида и протектора тиоловых групп 1,4-дитиоэритритола.
3. Оценить распределение по фазам клеточного цикла опухолевых клеток линии МСF-7 в интактной культуре и при действии блокатора SH-групп N-этилмалеимида и протектора тиоловых групп 1,4-дитиоэритритола.
4. Выявить роль компонентов системы тиоредоксина в дизрегуляции пролиферации опухолевых клеток линии МСF-7.
Введение

В настоящее время большое внимание уделяется механизмам дизрегуляции и повреждения клеточных систем при иммортализации клеток [3]. Несмотря на имеющиеся данные о функционировании опухолевых клеток, остается открытым вопрос о механизмах редокс-регуляции, управления пролиферацией клеток и «ускользания» от апоптотической гибели. Тиоредоксин способен взаимодействовать с АФК, восстанавливать окисленный глутатион, выступать кофактором рибонуклеотид- и метионинсульфоксидредуктаз, участвуя в репарации ДНК, сохранять дитиол/дисульфидную структуру белков [1], способствуя редокс-модуляции функционирования внутриклеточных протеинов, что дает возможность предположить его важную роль в регуляции прогрессии фаз клеточного цикла.

Методы и материалы

Исследования были выполнены с использованием опухолевой клеточной линии МСF-7 (аденокарцинома молочной железы человека). Клетки культивировали адгезионным методом в полной питательной среде в присутствии 5 мМ N-этилмалеимида (NEM) (“Sigma Aldrich”, США), необратимо связывающего SH-группы белков [4], или 5 мМ 1,4-дитиоэритритола (DTE) (“Sigma Aldrich”, США), протектора тиоловых групп протеинов [2].

Оценку содержания активных форм кислорода (АФК) проводили методом проточной цитофлуориметрии с 2,7-дихлорфлуоресцеиндиацетатом на проточном лазерном цитометре «FaCSCanto II» («Becton Dickinson», США). Концентрацию восстановленного и окисленного глутатиона определяли методом, предложенным M.E. Anderson (1985) в модификации I. Rahman et al. (2006). Внутриклеточное содержание тиоредосина определяли методом вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител («Thermo Scientific», США). Активность тиоредоксинредуктазы (КФ 1.8.1.9) определяли спектрофотометрическим методом, основанным на способности фермента катализировать NADPH-зависимое восстановление дисульфидных связей субстратов, реагирующих с 5,5-дитиобис-2-нитробензойной кислотой. Оценку распределения клеток линии МСF-7 по фазам клеточного цикла проводили методом проточной цитофлуориметрии по протоколу Cycle Test Plus («Becton Dickinson», США).

Статистическую обработку результатов проводили при помощи программы SPSS 11.0. Статистически значимыми считались различия при р<0,01.

Описание и обсуждение результатов

Нами установлено, что NEM в клетках линии MCF-7 вызывает развитие окислительного стресса (ОС), сопровождающегося увеличением внутриклеточной продукции АФК в 2,9 раза (р<0,01), снижением концентрации GSH в 2,0 раза (р<0,01) и уменьшением величины отношения GSH/GSSG в 2,2 раза (р<0,01) по сравнению с интактной культурой. Помимо системы глутатиона, редокс-гомеостаз клеток поддерживает тиоредоксинзависимая система, включающая тиоредоксин и торедоксинредуктазу. Однако, функционирование этой системы и ее редокс-потенциал в конечном итоге тесно связаны с работой системы глутатиона и отношения GSH/GSSG. Так, нами было установлено, что при действии NEM активность тиоредоксинредуктазы в клетках линии MCF-7 снижалась в 1,2 раза (р<0,01) по сравнению с интактной культурой, что может быть связано с недостатком НAДФH вследствие его интенсивного расхода в реакциях, катализируемых редуктазами или уменьшением продукции в пентозофосфатном пути. Смещение редокс-статуса в клетках линии MCF-7 под действием NEM в сторону окисления, приводило к увеличению содержания тиоредоксина, что отражало высокую потребность опухолевых клеток в антиоксидантах, необходимых для защиты макромолекул от ОС и выживания клеток, и сопровождалось нарушением в прохождении клеток аденокарциномы молочной железы по фазам клеточного цикла: их увеличение в S фазе 1,38 раза (р<0,01) и снижение в G0/G1 фазах в 1,25 раза (р<0,01) по сравнению с интактной культурой.

При культивировании клеток линии MCF-7 с DTE увеличивались концентрации GSH в 1,3 раза (р<0,01), GSSG – в 1,1 раза (р<0,01) и торедоксина – в 1,1 раза (р<0,01). Тиоредоксин является необходимым компонентом для поддержания редокс-гомеостаза клеток и репликации молекул ДНК. В клетках линии MCF-7, культивируемых с присутствием DTE, смещение редокс-статуса в сторону восстановления приводило к снижению пролиферативной активности: количество клеток в G0/G1 фазе увеличилось в 1,11 раза (р<0,01), а в S фазе – снизилось в 1,22 раза (р<0,05).

Таким образом, наши исследования показали важную роль редокс-белков, в частности тиоредоксина, в регуляции пролиферации клеток линии МСF-7. Можно предположить, что остановка клеточного цикла в S фазе при действии NEM и в G0/G1 фазе при действии DTE связана с изменениями активности редокс-чувствительных белковых комплексов, регулирующих пролиферацию (циклинов и циклинзависимых киназ).

Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского гуманитарного научного фонда в рамках научного проекта «Тиоредоксин и глутаредоксин – как молекулярные маркеры возникновения и развития опухолей молочной железы» № 15-36-01289.

Используемые источники
1. Калинина Е.В., Чернов Н.Н., Саприн А.Н. Участие тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах // Успехи биологической химии. - 2008. - Т. 48. С. 319–358.
2. Brunelli L., Crow J.P., Beckman J.S. The comparative toxicity of nitric oxide and peroxynitrite to Escherichia coli // Arch. Biochem. Biophys. - 1995. - Vol. 316(1), P. 327-333.
3. Halliwell B., Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? // British journal of pharmacology. – 2004. – Vol. 142. – №. 2. – P. 231-255.
4. Sahaf B., Heydari K., Herzenberg L.A. Lymphocyte surface thiol levels / Sahaf B., Heydari K., Herzenberg L.A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol. 100 (7). Р. 4001–4005.
Information about the project
Surname Name
Egorova Maria
Project title
THE ROLE OF THE THIOREDOXIN SYSTEM IN REGULATING BREAST ADENOCARCINOMA CELLS PROLIFERATION UNDER REDOX STATUS MODULATION
Summary of the project
Investigation of the role of redox-modulation by thioredoxin in regulatory activity of different cell proteins, including cyclins and cyclin-dependent kinase – modulators of proliferation, is an entirely new trend. This trend is very perspective for searching molecular markers of socially significant diseases and investigating breast tumor transformation sthat make the biggest part of cancer incidence among women in the world and in Russia, in particular.
Keywords
redox status; thioredoxin; proliferation; adenocarcinoma