Регистрация / Вход
Прислать материал

МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКА МИТОКСАНТРОНА В СМЕСИ С АРОМАТИЧЕСКИМИ ИНТЕРЦЕПТОРАМИ: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И КЛЕТОЧНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ

Сведения об участнике
ФИО
Сало Виктория Андреевна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Севастопольский государственный университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ АНТИБИОТИКА МИТОКСАНТРОНА В СМЕСИ С АРОМАТИЧЕСКИМИ ИНТЕРЦЕПТОРАМИ: СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И КЛЕТОЧНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ
Резюме
Исследовано совместное действие лигандов (кофеина, флавин-мононуклеотида и фуллерена) и противоопухолевого антибиотика митоксантрона на ядра клеток буккального эпителия человека, определено соотношение концентраций лиганд/митоксантрон для выраженного интерцепторного действия. Также проведен анализ взаимодействия выше перечисленных лигандов и митоксантрона методами спектрофотометрии.
Ключевые слова
фуллерен C60, клетки буккального эпителия человека, новатрон, флавин-мононуклеотид, кофеин, спектрофотометрия.
Цели и задачи
1. Исследование совместного действия лигандов (кофеина, флавин-мононуклеотида и фуллерена) и противоопухолевого антибиотика митоксантронана ядра клеток буккального эпителия человека, определение соотношения концентраций лиганд/митоксантрон для выраженного интерцепторного действия.
2. Анализ взаимодействия выше перечисленных лигандов и митоксантрона методами спектрофотометрии.
Введение

Ароматические биологически активные соединения образуют широко используемую в медицине группу лекарственных препаратов, механизм действия которых в большинстве случаев объясняется на уровне нековалентного взаимодействия с биополимерами в клетке.

Типичным представителем  цитостатических препаратов, используемых в химиотерапии, является митоксантрон (новатрон, NOV)р.1а

Фуллерен С60 (р.1,б) представляет собой сферическую молекулу, состоящую из атомов углерода. В последние годы немодифицированный фуллерен широко используют в медицине и нанобиотехнологии. В работе было показано, что фуллерен проявляет антиоксидантные свойства, способен подавлять рост злокачественных опухолей [1,2].

                          

а                                                              

                     

б                                                                

Рис. 1 – Структурные формулы NOV (а), C60 (б)

 

Методы и материалы

В качестве экспериментального материала использовались клетки буккального эпителия человека.Клетки помещались в 3.03 ммоль/л фосфатный буфер (рН=7.0) с добавлением 2.89 ммоль/л хлорида кальция. Состояние хроматина в клетках буккального эпителия человека оценивалось по количеству гранул гетерохроматина в ядрах клеток после окрашивания орсеином [4].Исследование процесса гетерохроматинизации позволяет оценить изменения функциональной активности клеточного ядра [5].Величина КГГ в каждом варианте эксперимента определялась в 30 ядрах. По отклонению полученного в опыте значения от контрольного значения КГГ делался вывод о среднем значении КГГ. Для проведения эксперимента производился отбор клеток у трех доноров. Доноры некурящие, женского и мужского пола 20 и 22 лет.

Электронные спектры поглощения исследуемых смешанных растворов новатрона и флавин-мононуклеотида регистрировали на спектрофотометре Unico4802HUV/VIS в видимой области спектра (400—730нм). Антибиотик митоксантрон и флавин-мононуклеотид (Sigma, США) использовались в экспериментах без дополнительной очистки. Все эксперименты проводились в условиях, близких к физиологическим. Температура в кюветах поддерживалась постоянной. При исследовании гетероассоциации NOV-FMN осуществлялось титрование флавин-мононуклеотида(0.1-М Na-фосфатный буфер) новатрономв диапазоне концентраций 2.5·10–4—3.9·10–6 M. Концентрация антибиотика в смешанном растворе поддерживалась постоянной C(NOV)= 4.5·10–5M.

Описание и обсуждение результатов

В эппендорфы, содержащие по 0.5 мл клеточной суспензии, добавляли по 0.5 мл смешанных растворов, содержащих постоянную концентрацию NOV (CNOV=5.9·10-8 М) и различные концентрации фуллерена. Таким образом, действующая концентрация новатрона составила CNOV=2.95·10-8 М, а фуллерена от 6.6·10-5 до 4.1·10-6 М. Время экспозиции составляло 1.5 часа. В качестве негативного контроля рассматривались значения КГГ клеток в буфере без препаратов, в качестве позитивного контроля  - КГГ клеток в растворе новатрона без добавления фуллерена. Результаты экспериментов представлены на рис.2. Для всех доноров данная зависимость носит схожий характер. 

Рисунок 2 – Временная зависимость показателя КГГ при постоянной концентрации NOV равной 2.95·10-8М и переменной концентрации фуллерена

 

Аналогично обнаруженному в данном исследовании влиянию С60 фуллерена на параметры КГГ  в клетках буккального эпителия можно ожидать и при замене С60 фуллерена на CAF и FMN, хорошо изученного в рамках теории интерцепторно-протекторного действия.

Следовательно, можно предположить, что существует непосредственное взаимодействие молекул исследуемого препарата с молекулами БАС, которое снижает биологический эффект, производимый NOV на ядра клеток, что косвенно согласуется теорией интерцепторно-протекторного действия, т.е. интерцепторно-протекторный механизм взаимодействия в указанных выше системах проявляется на клеточном уровне.

По данным спектрофотометрии в программе Exсel был построен график зависимости величины оптической плотности А от концентрации FMN в смешанном растворе NOV-FMN (рис. 3).

Рисунок 3 – График зависимости величины оптической плотности А от концентрации FMN в смешанном растворе NOV-FMN

Анализ взаимодействия новатрона и кофеина проводился по аналогичной методике, результаты расчетов представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Параметры гетероассоциации NOV (Y) и FMN/CAF (X) в 0.1 М фосфатном буфере pD=7.1 при T = 298K

 

KX

М-1

KY

М-1

KC

М-1

εm, M–1×см–1

εc M–1×см–1

NOV-FMN

400

75100

140000

19200

7000

NOV-CAF

11

751000

356

19200

4500

 

Из таблицы 1 следует значительное превышение равновесной константы гетероассоциации NOV+FMN над константами самоассоциации FMN и антибиотика. Это означает, что формирование  NOV+FMN гетерокомплексов энергетически более выгодно по сравнению с реакциями самоассоциации этих молекул. Также, это свидетельствует о наличии дополнительного стабилизирующего фактора в гетерокомплексе NOV+FMN, не связанного с дисперсионными или гидрофобными взаимодействиями. Т.е. можно предположить, что в гетерокомплексе NOV+FMN образуется водородная связь. Между NOV-CAF константа гетероассоциации принимает промежуточное значение,  следовательно, в данном гетерокомплексе  нет дополнительной стабилизации.

Используемые источники
1. Prylutska S, Grynyuk I, Matyshevska . Anti-oxidant properties of C60 fullerenes in vitro // Fuller nanotub Carbon nanostr. –2008.V.16. – №(5–6), – P. 698–705.
2. Prylutska S, Burlaka A, Prylutskyy YI, Ritter U, Scharff P. Pristine C60 fullerenes in-hibit the rate of tumor growth and metastasis // ExpOncol. – 2011. – V.33. – P.162–164.
3. Evstigneev M.P, Buchelnikov A.S., Voronin D.P., Rubin Y.U., Belous L.F., Pryluts-kyy Y., Ritter U. Complexation of C60 Fullerene with Aromatic Drugs //J. Chem-PhysChem. – 2013. – V.14. – P.568-578.
4. Shckorbatov, Y.G. He-Ne laser light induced changes in the state of chromatin in hu-man cells // Naturwissenschaften. – 1999. – V. 86. – № 9. – P. 452-453.
5. Shckorbatov Y.G., Shakhbazov V.G., Grigoryeva N.N., Grabina V.A. Microwave irradiation influences on the state of human cell nuclei // Bioelectromagnetics. – 1998, V.19. – № 7. – P.414-419.
Information about the project
Surname Name
V.A. Salo, A.S. Papkova, A.O. Lantushenko
Project title
MECHANISM OF ANTIBIOTICS MITOXANTRONE MIXED WITH AROMATIC INTERCEPTOR: SPECTROPHOTOMETRIC ANALYSIS AND CELLULAR EXPERI-MENT
Summary of the project
The combined effect of the ligands (caffeine, flavin mononucleotide and fullerene) and antitumor antibiotic mitoxantrone on human buccal epithelial cells has been studied. The concentration ratio for ligands and mitoxantrone is determined in which the interceptor action is expressed. Also, the analysis of the interaction of the above ligands and mitoxantrone of spec-trophotometric method has been performed.
Keywords
C60 fullerene, human buccal epithelial cells, novatrone, flavine mononucleotide, caffine, spectrophotometric.