Регистрация / Вход
Прислать материал

Биотехнология получения резиноида микроводорослей

Сведения об участнике
ФИО
Митишев Александр Владимирович
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пензенский государственный университет"
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Агро-, био- и производственные технологии
Раздел области наук
Земледелие и растениеводство
Тема
Биотехнология получения резиноида микроводорослей
Резюме
В работе представлены исследования альгокультур in vitrо. Выявлен наиболее перспективный штамм хлореллы в отношении накопления биомассы. Рассмотрены наиболее экономически целесообразные условия (аэрация, компонентной состав ферментационной среды, температура, рН и др.) культивирования штаммов хлореллы и экстракции сухой биомассы. Разработана технология получения резиноида микроводоросли. Приведены результаты макроскопического и фитохимического анализов. Определены основные токсикологические параметры LC50, LC100, LT50.
Ключевые слова
Биотехнология, резиноид, хлорелла, альгокультура, аромапродукт
Цели и задачи
Цель - разработать технологию получения резиноида на основе суспензионной альгокультуры
Задачи:
1) отбор высокоактивного штамма,
2) исследование влияния условий культивирования на уровень накопления биомассы,
3) получение и оптимизация состава ароматического продукта в соответствии с показателями резиноида «дубового мха».
4) изучить морфологические и физиологические изменения инфузорий Paramecium caudatum под влиянием резиноида хлореллы.
Введение

Резиноиды - душистые фиксаторы, используемые в качестве отдушек и красителей для пищевых, парфюмерных, косметических продуктов и товаров бытовой химии. Традиционным источником резиноида является «дубовый мох» или лишайники рода Evernia. «Дубовый мох» относится к малотоннажному виду сырья.

Объемы переработки лишайников последние несколько десятилетий неуклонно снижались. На сегодняшний день получение резиноида в мире, в частности, в России по сравнению с концом 20 века снизилось втрое. Причина в том, что ресурсы лишайника в доступных естественных местообитаниях быстро исчерпались. В связи с растущим спросом на этот натуральный продукт увеличивается интерес к альтернативным источникам его получения, а именно с применением биотехнологий.

Методы и материалы

Объектом исследования являлись суспензионные культуры и альгомасса штаммов Chlorella vulgaris ИФР С-66,  ИФР С-111 и ИФР С-2019,  предварительно высушенная и измельченная. Для получения суспензии хлореллы использовали среды Тамия, Хогланда, Майерса. Перемешивание суспензии производили с использованием универсального шейкера LOIP LS-110. Для определения живых и мертвых клеток водорослей использовали красители. Количество клеток определяли в камере Горяева и нефелометрическим методом. Количественную оценку аромапродукта проводили по ГФ XII. Химический состав сырья и биотехнологические показатели альгокультуры на средах Тамия и Хогланда анализировали общепринятыми методиками. Стеролы, триацилглицеролы определяли на КФК-3.01, жирные кислоты, хлорофилл, каротиноиды на спектрофотометре СФ-201. Упаривание экстракта осуществляли на роторном испарителе IKA RV 10 basic V.  Биотестирование проводили на 10-тисуточной культуре клеток Paramecium caudatum, выращенной на сенном настое согласно МР ЦОС ПВ Р 005-95. Для анализа готовили серийные разведения резиноида хлореллы в дистиллированной воде в концентрациях 0,96; 1,93; 3,85; 7,7; 30,8 мг/мл. Наблюдения за поведением инфузорий осуществляли с использованием стереомикроскопа Биомед МС-2 с 45-тикратным увеличением (4.5х,10х) в интервалах 1 мин, 1 ч, 3 ч, 6 ч, 24 ч, 48 ч. Определение токсикологических параметров LC50LC100LT50 проводили по МУ 1.1.726-98. Достоверность результатов определяли с помощью критерия (t) Стьюдента.

Описание и обсуждение результатов

Селекционированный нами штамм С. vulgаris С-2019 обладает наибольшей биосинтетической активностью, так как при культивировании в лабораторных условиях быстрее накапливал биомассу по сравнению со штаммами С-66, С-111.

Подобраны наиболее благоприятные условия интенсивного культивирования хлореллы: среда Тамия, с использованием перемешивающего устройства (количество клеток штаммов C. vulgаris С-111 увеличилось в 2,4 раза, С-66 в 2,0 раза и С-2019  в 3,3 раза), поддержание температуры в пределах 30...350С, освещенности 6 000...14 000 люкс и рН в пределах от 6,5 до 7,5.

Получение  резиноида предусматривает последовательную трехкратную экстракцию сухой биомассы этиловым спиртом 96%, предварительно подогретым до 700С в течение 3, 2, 1 ч при 700С. Первое настаивание проводили в течение 3 ч с периодическим помешиванием. Сухую биомассу хлореллы заливали этанолом в весовом соотношении 1:3. После экстракции мисцеллу сливали, а биомассу заливали чистым спиртом в весовом соотношении 1:2 и проводили второе, третье настаивание в течение 2, 1 ч. Спиртовые растворы сливали, объединяли, фильтровали и концентрировали до 14...18%. В вакуум-аппарате окончательно отгоняли спирт при остаточном давлении 0,053-0,06 мПа и температуре не выше 600С. Наибольший выход резиноида наблюдался  при температуре 700С - 16%. При этом увеличивается эфирное число, улучшается запах, усиливается интенсивность окраски (от светло-зеленой до темно-зеленой).

Макроскопический анализ показал, что резиноид хлореллы - это густая,  смолянистая жидкость от темно-зеленого до коричневого цвета. Запах приятный, с табачно-травянистой нотой. Плотность 0,978...0,988 г/см3; кислотное число 20,6...25,03; эфирное число 16,41...18,21. Ароматический продукт,  полученный экстракцией биомассы водорослей, по  основным показателям соответствует стандарту ОСТ 18-223-75. Проведенный фитохимический анализ целевого продукта позволил установить содержание липофильных соединений  около 60%, в том числе глико- и фосфолипиды 52,4%, стеролы 0,03%, триацилглицеролы 2,4%, жирные кислоты 2,1%. Содержание витаминов относительно велико, в частности, водорастворимых группы В (В1, В2, В6) - 0,2% , каротиноидов - до 1%. Содержание растительных пигментов - хлорофиллов а и b находится в  пределах 0,9...2,4%.

Для использования резиноида хлореллы необходимы доказательства безопасности для жизни и здоровья людей. С этой целью было проведено биотестирование для выявления токсических эффектов с использованием Paramecium caudatum. Критериями токсического действия являются летальность (%), изменение плотности культуры и изменение характера движения. Проведенное исследование образцов резиноида позволило определить  среднюю летальную концентрацию LC 50 = 3,86 мг/мл; среднюю эффективную концентрацию ЭК 50 = 1,93 мг/мл; LC 100 = 30,8 мг/мл при экспозиции 48 часов, а также среднее время выживания LT 50 = 60 мин.

Используемые источники
1. Сравнительный анализ штаммов продуцента и инновационного продукта как основных элементов биотехнологии резиноида хлореллы / А.В. Митишев, Е.В. Преснякова, Е.Ф. Семенова и др. // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Серия «Естественные науки», 2014. - № 4 (8). – С.19-29.
2. Шпичка, А.И., Семенова Е.Ф. Сравнительная характеристика микроорганизмов, синтезирующих de novo летучие душистые вещества // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 8 (часть 5). – С. 1113–1124.
3. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике / Л.А. Сиренко, А.И. Сакевич, Л.Ф. Осипов, и др.– К.: Наукова думка, 1975. – 247 с.
4. Музафаров А.М., Таубаев Т.Т. Культивирование и применение микроводорослей. – Ташкент: Фан УзССР, 1984. – 136 с.
Information about the project
Surname Name
Aleksandr Mitishev
Project title
Biotechnology of algal resinoid production
Summary of the project
The research of algal cultures in vitro is presented in this study. The most promising chlorella strain, which possesses the highest biomass yield, is revealed. The conditions (aeration, medium component content, temperature, pH, etc.) of chlorella strain cultivation and extraction from dry biomass are investigated, and the most rational ones are chosen. The technology of algal resinoid production is developed. The results of macroscopic and phytochemical analyses are shown. The toxicological parameters LC50, LC100, LT50 were found out.
Keywords
Biotehnology, chlorella resinoid, algal culture, fragrant product