Регистрация / Вход
Прислать материал

Определение условий денатурации различных конформаций альбумина человека методом дифференциальной сканирующей калориметрии

Сведения об участнике
ФИО
Ворожцова Юлия Сергеевна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики"
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Химия и химические технологии
Раздел области наук
Физическая химия. Электрохимия. Физические методы исследования химических соединений
Тема
Определение условий денатурации различных конформаций альбумина человека методом дифференциальной сканирующей калориметрии
Резюме
В рамках исследования по диагностированию заболеваний экспресс-методами в проекте были определены условия денатурации альбумина человека в различных его конформациях: в лиофилизованной и растворенной форме при помощи метода дифференциальной сканирующей калориметрии. В результате работы были сделаны выводы о чувствительности метода к изменению структуры и количества белка (к различным конформациям), в соответствии с которыми растворенная форма альбумина была определена как наиболее подходящая для дальнейших исследований.
Ключевые слова
Дифференциальная сканирующая калориметрия, денатурация белка, альбумин, конформация
Цели и задачи
Цель проекта: определение условий денатурации различных конформаций альбумина человека методом ДСК.
Задачи проекта: определить значения параметров денатурации альбумина человека в лиофилизованной и растворенной формах методом ДСК и сравнить полученные результаты; сделать выводы о чувствительности метода к различным конформациям белка и определить наиболее подходящую из них для дальнейших исследований.
Введение

В настоящее время все большую актуальность приобретает вопрос оперативного выявления заболеваний на как можно более ранней стадии их развития. Этой проблеме посвящена работа на тему диагностирования заболеваний путем исследования альбумина человека экспресс-методами. Начальным этапом является подбор оптимальной для проведения исследования конформации белка. 

Методы и материалы

Материалом исследования является сывороточный альбумин – преобладающий белок в плазме крови человека (около 55%), что делает его одним из основных показателей для диагностирования заболеваний. Белки состоят из конечного числа аминокислотных последовательностей. При возникновении мутации, сопровождающей наступление болезни,  их число имеет свойство изменяться. Меняется также и структура, а именно, конформация белка.  Установлено, что в растворенной и лиофилизованной формах, альбумин имеет различные конформации (как и в случае наступления болезни). Поэтому альбумин человека в жидкой форме и альбумин человека в лиофилизованной форме были определены в качестве исследуемых образцов. Известно, что изменение числа аминокислотных последовательностей (вследствие непосредственного изменения массы) влияет на термические характеристики белка, например, на количество теплоты, используемое на его нагревание или на теплоемкость. Метод, позволяющий определять эти параметры – метод дифференциальной сканирующей калориметрии, принцип которого заключается в измерении разности тепловых потоков между образцом и эталоном. Термограммы ДСК позволяют получить информацию об условиях происходящих в образце процессах, которые сопровождаются выделением или поглощением тепла по мере нагревания или охлаждения образца. В нашем случае образцы подвергались нагреванию от 5 до 92°С в калориметре Netzsch DSC 204 F1 Foenix со скоростью 2 К/мин.

Описание и обсуждение результатов

В результате проведения эксперимента были получены термограммы зависимости теплового потока, используемого на нагревание/охлаждение образца от его температуры (рисунке 1).

 

Рисунок 1 – Термограммы образцов альбумина человека в лиофилизованной (А) и растворенной (В) формах.

Здесь кривая А соответствует образцу альбумина человека в лиофилизованной форме, В – в растворенной форме. Кривые не совпадают между собой, что говорит о возможности данным методом улавливать изменения, связанные с количеством и конформацией белков. Логично предположить, что в процессе лиофилизации альбумин вместе со своей жидкой составляющей потерял часть молекулярной массы, поэтому его ДСК-кривая оказалась ниже кривой его растворенной формы.

С помощью программного обеспечения прибора определены характеристические пики, дающие информацию об условиях денатурации альбумина человека в лиофилизованной и растворенной формах (рисунок 2).

Рисунок 2 – Условия денатурации альбумина человека в лиофилизованной (А) и растворенной (В) формах.

Температура денатурации лиофилизованного белка равна 56,11°С, значение теплового потока при этом равно -0, 05473 мВт/мг. Для растворенной формы белка значения соответственно равны 60,87°С и 0,1373 мВт/мг. Из рисунков можно заключить, что наиболее явный характеристический пик наблюдается у альбумина в растворенной форме. Это делает его в наибольшей степени  подходящим для проведения дальнейших измерений в рамках исследования, так как он может дать в результате более четкую термограмму. Подтвердим это заключение, построив температурную зависимость удельной теплоемкости исследуемых образцов. Для этого следует провести перерасчет полученных данных по формуле: 

\(C_S = {C_R*(J_S-J_B)/(J_R-J_B )}, \)

где: CS - теплоёмкость образца, Дж·К-1·г-1;

       CR - удельная теплоёмкость образца сравнения (сапфир), Дж·К-1·г-1;

       JS, JB, JR - тепловой поток при измерении образца, базовой линии и образца сравнения, мВт.

Полученная зависимость представлена на рисунке 3. 

Рисунок 3 – Температурная зависимость удельной теплоемкости альбумина человека в лиофилизованной и растворенной формах.

Из графика на рисунке 3 можно сделать вывод, что при разнице температур денатурации примерно в 5°С, значения удельных теплоемкостей различаются в три раза (меньшее значение имеет альбумин в лиофилизованной форме).

Сведем полученные данные условий денатурации образцов в таблицу 1.

Таблица 1 - Условия денатурации образцов

Форма\Параметр 

Температура, °С

Энтальпия, мВт/мг

Удельная теплоемкость, Дж/(г*К)

Лиофилизованная 

56 -0,05 115

Жидкая

61 0,14 375

 

Денатурация альбумина в процессе нагревания в лиофилизованной форме происходит раньше, чем в растворенной. Однако, отметим, что метод оказался более чувствительным к растворенной (значит, наиболее подходящей для дальнейших исследований) форме альбумина (в этом случае четче обозначены характеристические пики). 

 

      

 

Используемые источники
1. Берштейн В. А., Егоров В. М. Дифференциальная сканирующая калориметрия в физикохимии полимеров / Берштейн В. А. Егоров В. М. – Л.: Химия, 1990, - 256 с.
2. Michnik A., Drzazga Z., Michalik K., Barczyk A., Santura I., Sozan´ska E., Pierzchała W. Differential scanning calorimetry study of blood serum in chronic obstructive pulmonary disease. / J Therm Anal Calorim (2010) 102:57–60
Information about the project
Surname Name
Vorozhtsova Iuliia
Project title
Determination of denaturation conditions of various human albumin conformations by differential scanning calorimetry
Summary of the project
Denaturation conditions of various human albumin conformations (lyophilized and dissolved) are determined by differential scanning calorimetry within the study of the diagnosis of diseases by express methods. As a result conclusions about the sensitivity of the method to change of the structure and the amount of protein (to various conformations) are made. Dissolved form of albumin is determined as most appropriate for further studies.
Keywords
Differential scanning calorimetry, protein denaturation, albumin, conformation