Регистрация / Вход
Прислать материал

Роль ксантиноксидазы в развитии окислительного стресса в жировой ткани крыс при экспериментальном сахарном диабете

Сведения об участнике
ФИО
Перекуча Наталья Андреевна
Вуз
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Роль ксантиноксидазы в развитии окислительного стресса в жировой ткани крыс при экспериментальном сахарном диабете
Резюме
Впервые установлена роль ксантиноксидазы в механизмах активации свободнорадикального окисления липидов в жировой ткани и изолированных адипоцитах при экспериментальном аллоксановом и стрептозотоциновом диабете у крыс.
Полученные данные о способности аллопуринола снижать интенсивность свободно-радикального окисления расширяют существующие представления о роли окислительного стресса и ксантиноксидазы в патогенезе сахарного диабета типа 1 и могут стать основой для разработки способов фармакологической коррекции осложнений сахарного диабета.
Ключевые слова
Ксантиноксидаза Окислительный стресс Сахарный диабет
Цели и задачи
Цель: установить роль ксантиноксидазы в формировании окислительного стресса в эпидидимальной жировой ткани и адипоцитах крыс при экспериментальном сахарном диабете типа 1.
Задачи:
1. Определить содержание гидроперекисей липидов в сыворотке крови, эпидидимальной жировой ткани и изолированных адипоцитах крыс при аллоксановом и стрептозотоциновом диабете.
2. Оценить ксантиноксидазную и ксантиндегидрогеназную активность в сыворотке крови, эпидидимальной жировой ткани и изолированных адипоцитах крыс при аллоксановом и стрептозотоциновом диабете.
3. Оценить экспрессию мРНК ксантиндегидрогеназы в эпидидимальной жировой ткани и изолированных адипоцитах крыс при аллоксановом и стрептозотоциновом диабете.
4. Выявить влияние ксантиноксидазы на уровень гидроперекисей липидов в сыворотке крови, эпидидимальной жировой ткани и изолированных адипоцитах крыс с использованием ингибитора аллопуринола в условиях окислительного стресса при экспериментальном аллоксановом диабете.
Введение

Согласно современным представлениям в механизмах возникновения СД 1 и 2 типов и развития их осложнений важную роль играет окислительный стресс. Источниками АФК при СД являются реакции гликозилирования белков, дыхательная цепь митохондрий, мембраносвязанная НАДФН-оксидаза и другие ферменты. Важным ферментативным источником супероксид-анион радикала (О2•¯) и Н202 является ксантиноксидоредуктаза, которая в нормальных условиях находится преимущественно в ксантиндегидрогеназной форме и может обратимо или необратимо переходить в ксантиноксидазу, в результате образования дисульфидных связей цистеиновых остатков Cys535 и Cys992.

 

Методы и материалы

Эксперимент проводился на 24 крысах самцах  массой – 350 г. Животные были разделены на 3 группы (8 – контрольные , 8 – с аллоксановым диабетом и 8- со стрептозотоциновым диабетом). 

Через четырнадцать дней после введения диабетогенов животных умерщвляли СО2-асфиксией, в сыворотке крови определяли уровень глюкозы, мочевой кислоты, гидроперекисей липидов (ГПЛ) и ксантиндегидрогеназную (КД) и ксантиноксидазную (КО) активность.

В жировой определяли содержание гидроперекисей липидов, активность ферментов и оценивали экспрессию Xdh. С использованием коллагеназы выделили фракцию зрелых адипоцитов, в которых определяли те же параметры.

Для доказательства участия активации ксантиоксидазы в развитии окислительного стресса при А диабете мы провели серию экспериментов с ингибированием КО у крыс аллопуринолом. Результаты оценивали по уровню глюкозы в сыворотке крови и содержанию гидроперекисей липидов в сыворотке крови, жировой ткани и адипоцитах крыс.

Глюкозу  и мочевую кислоту в сыворотке крови определяли с помощью ферментативных наборов фирмы Chronolab. ГПЛ - FOX-2 методом. Белок колориметрическим методом.

КО и КД-активность определяли с использованием  субстрата птерина по интенсивности флуорисценции продукта реакции – изоксантоптерина (Sigma). 

Из тканей получали гомогенаты - Выделение мРНК - Получение кДНК (обратная транскрипция по матрице РНК). Проводили ПЦР в реальном времени, с помощью которой выполняли оценку экспрессии генов.

Описание и обсуждение результатов

В результате исследования нами было установлено, что в сыворотке крови животных с экспериментальным сахарным диабетом развивалась гипергликемия  и гиперурикемия. Также значительно стимулируется свободнорадикальное окисление липидов, о чем свидетельствует увеличение содержания в ней гидроперекисей липидов, определенных FOX-2 методом - при аллоксановом диабете в 3,1 раза (p<0,05) и при стрептозотоциновом и 3,6 раза (p<0,05). Повышение продукции гидроперекисей липидов может быть обусловлено гипергликемией, которая, как известно, является основным источником повышенной генерацией активных форм кислорода при диабете.

Также в сыворотке крови крыс с аллоксановым и стрептозотоциновым диабетом наблюдалось повышение ксантиндегидрогеназной и ксантиноксидазной активности. Причем увеличился вклад ксантиноксидазной активности в общую ксантиндегидрогеназную активность.

В жировой ткани при аллоксановом и при стрептозотоциновом диабете содержание гидроперекисей увеличивалось в 1,4 раза (p<0,05) и в 1,5 раза (p<0,05) соответственно по сравнению с контрольными значениями. Также увеличивалась ксантиндегидрогеназная и ксантиноксидазная активность . При этом у животных с диабетом увеличивалось отношение ксантиноксидазной активности к ксантиндегидрогеназной до 0,84 при аллоксановом и 0,88 при стрептозотоциновом по сравнению с контрольной группой.

В адипоцитах активность исследуемых ферментов возрастала в большей степени и увеличивалось содержание гидроперекисей липидов 1,6 раз (p<0,05) и 1,7 раза (p<0,05) соответственно.

То, что сходные изменения наблюдаются как при аллоксановом, так и при стрептозотоциновом диабете свидетельствует о том, что данные изменения обусловлены гипоинсулинемией и гипергликемией, а не токсическим действием диабетогенов.

Экспрессия ксантиндегидрогеназы значительно увеличивается в жировой ткани и зрелых адипоцитах крыс с экспериментальным диабетом.

Увеличение ксантиноксидазной активности и увеличение продукции гидроперекисей липидов при аллоксановом и стрептозотоциновом диабете обусловлено, в определенной мере, во-первых, повышением экспрессии ксантиндегидрогеназы, а во-вторых, пострансляционной модификацией ксантиндегидрогеназной активности в ксантиноксидазную.

Для доказательства роли ксантиноксидазы в развитии окислительного стресса в сыворотке крови, жировой ткани и адипоцитах нами была проведена серия экспериментов с введением ингибитора ксантиноксидазы аллопуринола крысам с аллоксановым диабетом. В результате было установлено значительное снижение гидроперекисей липидов.

Таким образом, аллопуринол снижает индуцированный аллоксаном повышенный уровень гидроперекисей липидов в сыворотке крови, жировой ткани и изолированных адипоцитах крыс, что свидетельствует о важной роли ксантиноксидазы в развитии окислительного стресса при экспериментальном диабете типа 1.

Используемые источники
1. Балаболкин, М. И. Диагностика и классификация сахарного диабета
2. Владимиров, Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты
3. Егоров, А.Д. Молекулярные и клеточные механизмы адипогенеза
4. Илюхина, О.Б., Анализ эффективности применения урикодепрессоров при сахарном диабете 2 типа
6. Cheung, K.J. Xanthine oxidoreductase is a regulator of adipogenesis and PPARgamma activity
7. Lenzen, S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes
8. Rains, J. L. Oxidative stress, insulin signaling, and diabetes
9. Rajesh, M. Xanthine oxidase inhibitor allopurinol attenuates the development of diabetic cardiomyopathy
10. Metabolism of isolated adipocytes. I. Effects of hormones on glucose metabolism and lipolysis
11. Suriyajothi, M.A. Activity of xanthine oxidase in diabetics: its correlation with aging
Information about the project
Surname Name
Perekucha Natalia Andreevna
Project title
The role of xanthine oxidase in oxidative stress in adipose tissue of rats with experimental diabetes
Summary of the project
For the first time the role of xanthine oxidase in the mechanisms of activation of free radical oxidation of lipids in adipose tissue and isolated adipocytes in experimental and streptozotocin alloxan diabetes in rats.
The obtained data on the ability of allopurinol to reduce the intensity of free radical oxidation extend existing ideas about the role of oxidative stress and xanthine oxidase in the pathogenesis of diabetes mellitus type 1 and can be the basis for the development of methods of pharmacological correction of complications of diabetes.
Keywords
xanthine oxidase adipose tissue oxidative stress diabetes