ДВУМЕРНЫЕ ГЕТЕРОКОРРЕЛЯЦИОННЫЕ ЯМР ЭКСПЕРИМЕНТЫ И АНАЛИЗ ВЕЛИЧИН ОСТАТОЧНОГОДИПОЛЬ-ДИПОЛЬНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ В ОПРЕДЕЛЕНИИ СТРУКТУРЫ БЕТА-АМИЛОИДА Aβ13-23 В РАСТВОРЕ

В 1991 году была предложена «амилоидная гипотеза», согласно которой базовой причиной заболевания являются отложения бета-амилоида (Aβ). Ген, кодирующий белок (APP), из которого образуется бета-амилоид, расположен на 21 хромосоме. Установлено, что болезнь Альцгеймера является протеинопатией – заболеванием, связанным с накоплением в тканях мозга ненормально свёрнутых белков – бета-амилоида и тау-белка.
Анализируя данные о наличии кросс-пиков в двумерных 1Н-1H TOCSY и 1Н-1H COSY спектрах были отнесены сигналы протонов CH, CH2 и CH3 групп аминокислот исследуемого бета-амилоида и установлено наличие 11 групп сигналов соответствующих различным аминокислотным остаткам

- Получить данные о химических сдвигах ядер 1H с помощью двумерного гетероядерного корреляционного 1H-13C HSQC эксперимента ЯМР. Провести отнесение сигналов ядер 13C для Аβ13-23 в растворе 20 мМ фосфатного буфера при pH=7.3 и T=293 K;

- Освоены методы проведения двумерных гомо- и гетероядерных корреляционных экспериментов ЯМР (1H-1H TOCSY, 1H-13C HSQC);

- С помощью полученных экспериментальных данных о химических сдвигах 1H и 13C была подтверждена химическая структура бета-амилоида Аβ13-23.

Болезнь Альцгеймера (также сенильная деменция альцгеймеровского типа) – на данный момент, неизлечимое нейродегенеративное заболевание.
Бляшки образуются из малых пептидов длиной в 39-43 аминокислоты, именуемых бета-амилоидом (A-beta, Aβ). Бета-амилоид является фрагментом более крупного белка-предшественника – APP. Этот трансмембранный белок играет важную роль в росте нейрона, его выживании и восстановлении после повреждений. Этот трансмембранный белок играет важную роль в росте нейрона, его выживании и восстановлении после повреждений. При болезни Альцгеймера по неизвестным пока причинам APP подвергается протеолизу – разделяется на пептиды под воздействием ферментов.
 

         Изученный в работе бета-амилоид Aβ_13-23 был синтезирован в лаборатории пептидного синтеза, отделения химии поверхностных явлений, технического университета Лулео под руководством доктора физико-математических наук Филиппова А.В. (Luleå University of Technology, Luleå, SE-91187, Sweden).

         Бета-амилоид был растворен в 20 мМ фосфатном буфере (90% H₂O + 10% D₂O) при pH = 7.3 и T = 293°K.

¹H и ¹³C эксперименты ЯМР для бета-амилоида Aβ_13-23  в растворе 20 мМ фосфатного буфера были проведены на ЯМР спектрометре Avance-500 (Bruker) (500 МГц (¹Н), 125.76 МГц (¹³С)) при температуре 293 K.

Изученный в работе бета-амилоид Aβ_13-23 был синтезирован в лаборатории пептидного синтеза, отделения химии поверхностных явлений, технического университета Лулео под руководством доктора физико-математических наук Филиппова А.В. (Luleå University of Technology, Luleå, SE-91187, Sweden).

         Бета-амилоид был растворен в 20 мМ фосфатном буфере (90% H₂O + 10% D₂O) при pH = 7.3 и T = 293°K.

¹H и ¹³C эксперименты ЯМР для бета-амилоида Aβ_13-23  в растворе 20 мМ фосфатного буфера были проведены на ЯМР спектрометре Avance-500 (Bruker) (500 МГц (¹Н), 125.76 МГц (¹³С)) при температуре 293 K.

         Отнесение сигналов в спектрах ЯМР на ядрах ¹H и ¹³С проводилось по методике совместного использования TOCSY и HSQC экспериментов.

В спектрах ¹Н-¹H TOCSY и ¹Н-¹H COSY экспериментов наблюдалось наличие 11 групп сигналов соответствующих различным аминокислотным остаткам. Таким образом, анализируя данные о наличии кросс-пиков в двумерных ¹Н-¹H TOCSY и ¹Н-¹H COSY спектрах были отнесены сигналы протонов CH, CH₂ и CH₃ групп аминокислот исследуемого бета-амилоида и установлено наличие 11 групп сигналов соответствующих различным аминокислотным остаткам (таблица 1).  Полученные данные ¹H химических сдвигах исследуемого пептида приведены в таблице 1. В спектрах экспериментов ¹Н-¹H TOCSY и ¹Н-¹H COSY было невозможно различить кросс-пики для аминокислотных остатков Phe 19 и Phe 20, поэтому в дальнейшем будем обозначать их Phe(1) (¹H ХС амидного протона 8.25 м.д.) и Phe(2) (¹H ХС амидного протона 8.16 м.д.).

Таблица 1. Экспериментальные данные ЯМР ¹H химических сдвигов бета-амилоида Aβ_13-23 в растворе 20 мМ фосфатного буфера (90% H₂O + 10% D₂O) при pH = 7.3 и T = 293 K.

	NH	Ha	Hb	Hg	Прочие
His13		4.67	3.23, 3.11
His14	8.40	4.60	3.16, 3.06		7.31 (H2), 7.19 (H4)
Gln15		4.32	2.06, 1.99	2.35
Lys16	8.25	4.58	1.78	1.41	2.99 (e), 1.68 (d)
Leu17	8.33	4.34	1.49	0.83, 0.76	0.92, 0.86
Val18	7.97	4.05	1.92
Phe (1)	8.25	4.32	3.01, 2.92		6.91(2/6), 7.12 (3/5)
Phe (2)	8.16	4.58	3.11, 2.95		6.90 (2/6), 7.21(3/5)
Ala21	8.27	4.23	1.37
Glu22	8.48	4.24	2.09, 1.95	2.29
Asp23	8.34	4.57	2.69

 

В ¹H-¹³C HSQC спектре ЯМР бета-амилоида Aβ_13-23 в растворе 20 мМ фосфатного буфера наблюдались кросс-пики между сигналами ядер ¹H и ¹³C.    Сопоставляя значения ХС ядер ¹H полученных из ¹H-¹H TOCSY и ¹H-¹H COSY экспериментов (таблица 2) были отнесены соответствующие им сигналы ядер ¹³C в двумерном ¹H-¹³C HSQC спектре ЯМР.

Таблица 2 - Экспериментальные данные ЯМР ¹³С химических сдвигов бета-амилоида Aβ_13-23 в растворе 20 мМ фосфатного буфера (90% H₂O + 10% D₂O) при pH = 7.3 и T = 293 K.

	Cα	Cβ	Cγ	Прочие
His13	50.15	25.82
His14	52.22	26.2
Gln15	53.18	26.89	30.79
Lys16		30.2		26.34, 39.04
Leu17	52.18	21.89	24.16	20.71,20.92
Val18	59.15	30.2	17.54,18.37
Phe(1)	52.94
Phe(2)		37.14
Ala21	49.46	16.4
Glu22	53.67	21.37
Asp23	54.46	30.31

 

1. Usachev, K. Klochkov V. Spatial structure of beta-amyloid Aβ1-40 in complex with a biological membrane model
2. Usachev, K. Klochkov V. Solution structures of Alzheimer’s amyloid Aβ13-23 peptide: NMR studies in solution and in SDS
3. Coles, M. Solution Structure of Amyloid β-Peptide (1-40) in a Water-Micelle Enviroment. Is the Membrane-Spanning Domain Where We Think It Is?
4. Selkoe D.J., Presenilins, beta-amyloid precursor protein and the molecular basis of Alzheimer’s disease
6. Nistor, M. Alpha- and beta-secretase activity as a function of age and beta-amyloid in Down syndrome and normal brain
7. Lott, I. Alzheimer disease and Down syndrome: factors in pathogenesis
8. Keeler, J. Understanding NMR Spectroscopy
9. Дероум, Э. Современные методы ЯМР для химических исследований
10. Vivekandan, S. A partially folded structure of amyloid-beta in an aqueous environment.

In 1991 he proposed the "amyloid hypothesis" according to which the basic cause of the disease are deposits of beta-amyloid (Aß). The gene encoding protein (APP), which formed beta-amyloid, located on chromosome 21. It is established that Alzheimer's disease is proteinopathy is a disease associated with the accumulation in the brain tissue abnormally folded proteins – beta amyloid and Tau protein.
Analyzing the data on the presence of cross-peaks in two-dimensional 1H-1H TOCSY and 1H-1H COSY spectra were assigned to the signals of the protons of CH, CH2 and CH3 groups of amino acids of the studied beta-amyloid and the presence of 11 groups of signals corresponding to different amino acid residues