Регистрация / Вход
Прислать материал

Эффективные липосомальные системы доставки лекарственных препаратов нового поколения

Сведения об участнике
ФИО
Лунева Анастасия Сергеевна
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования«Московский технологический университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Медицинские биотехнологии
Тема
Эффективные липосомальные системы доставки лекарственных препаратов нового поколения
Резюме
Многие заболевания человека, вызванные генными аномалиями, не поддаются лечению обычной терапией. В последнее время для лечения различных заболеваний развивается генная терапия, основанная на введении в организм терапевтических нуклеиновых кислот (НК).
Главной проблемой генной терапии является разработка эффективных систем доставки. Одной из перспективных систем являются катионные липосомы. Данная работа рассматривает возможные пути оптимизации технологии получения катионных липосом, для которых были определены основные технологические параметры получения и проведена оценка влияния этих параметров на физико-химические характеристики и биологическую активность.
Ключевые слова
Биотехнология, генная терапия, системы доставки лекарственных препаратов, липиды, липосомы, трансфекция
Цели и задачи
Для того, чтобы лекарственный препарат эффективно функционировал в организме, необходимо, чтобы он был доставлен в нужное место, в нужном количестве, в нужное время.
Биофармацевтические препараты на основе нуклеиновых кислот включают плазмидные ДНК, антисмысловые олигонуклеотиды, малые интерферирующие РНК, рибозимы, ДНК-энзимы и аптамеры. Для достижения максимального лечебного эффекта нуклеиновых кислот необходимо создать такие транспортные системы, которые будут эффективно доставлять генетический материал в клетку.
В последнее время липосомы находят все большее признание в мире как перспективные носители лекарственных веществ, поскольку многочисленные клинические испытания показали, что лекарства, вводимые в состав липосом, более эффективны и менее токсичны, чем в свободном виде.
Целью данной работы является разработка и оптимизация технологии получения липосомальной системы доставки, которую можно использовать для различных типов нуклеиновых кислот. Задачами работ станут изучение влияния контролируемых технологических параметров на характеристики конечного продукта, исследование распределения по размерам липидных дисперсий, изучение морфологии образования комплексов НК с липидными дисперсиями (липоплексов), а также их биологической активности.
Введение

 

Генная терапия  основана на введении терапевтических нуклеиновых кислот в клетки-мишени для лечения различных заболеваний. Одной из перспективных систем доставок являются катионные липосомы. Однако для этих систем имеется ряд недостатков, связанных с низкой эффективностью и отсутствием специфичности доставки НК [1].

На сегодняшний день разработаны различные типы липосомальных систем доставки НК и других лекарственных средств. Для увеличения эффективности действия необходим индивидуальный подход, так как требуется получить образцы с определенными параметрами. Необходимо выявлять оптимальные методы получения липосом и комплексов с нуклеиновыми кислотами, изучать влияние основных параметров на свойства образцов и их стабильность [2].

 

Методы и материалы

Для обеспечения воспроизводимых результатов необходимо соблюдать технологические требования по производству катионных липосом.

Для получения катионных липосом были использованы: ротационный испаритель (лабораторный ротационный испаритель Hei-VAP Value G3 или его аналог), шейкер с термостатом (метод гидратации липидной пленки), система ультразвуковой обработки (Bandelin Sonorex Digitec DT 52H или ее аналог), экструдер (Avanti Polar Lipids ) c поликарбонатными мембранами с размер пор 100 нм, система фильтрации (стерильный шприцевой фильтр Chromafil с размером пор 450 нм).

Для проверки качества полученного продукта необходимо провести измерение размера, поверхностного заряда и определить трансфицирующую активность.

Измерение размера и поверхностного заряда проводится с помощью метода динамического лазерного светорассеяния на приборе Delsa Nano C (или его аналогах) и трансмиссионной электронной микроскопией.

Проверка эффективности образования комплексов нуклеиновых кислот с катионными липосомами осуществляется с помощью систем гель-электрофореза (источник питания PowerPack Basic, камера для горизонтального электрофореза SE-2, для вертикального электрофореза VE-10), а также с помощью флуоресцентного спектрометра Varian (или его аналогов). По интенсивности флуоресценции образца можно судить о доле свободной НК, не вошедшей в состав липоплекса.

Проверка биологической активности осуществляется на цитофлуориметре Cytomics FC500 (или его аналогов).

Описание и обсуждение результатов

По своей природе НК не способны самостоятельно проникать через биологические мембраны в клетки, поэтому создание эффективных невирусных систем доставки НК является актуальной проблемой на сегодняшний день [3]. Оптимизация технологии получения систем доставки НК представляет собой многостадийную задачу: выбор оптимального метода получения липосом; проведение оптимизации выбранного метода для упрощения схемы приготовления; создание липоплексов и изучение их характеристик.

В качестве основных компонентов липосомальной системы доставки НК были выбраны поликатионный липид 1,26-бис(холест-5-ен-3β-илоксикарбониламино)-7,11,16-2-тетраазагексакозан тетрагидрохлорид и нейтральный липид 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин, взятые в мольном соотношении 1:1.

Для получения липосом нами было выбрано два способа: ультразвуковая обработка и экструзия [4,5]. 

Были получены три образца катионных липосом:

  • L2 - стерильная вода + ультразвуковое озвучивание;
  • L3 - стерильная вода + экструзия;
  • L4 - раствор Рингера + ультразвуковое озвучивание.

Установлено, что наименьшим размером частиц обладали липосомы L2 [6]. Все образцы были положительно заряжены.

Липосомы L2 и L3 представляли собой стабильные коллоидные композиции, размер частиц которых не изменялся в течение 30 недель.

 

Для понимания профиля доставки НК была исследована способность образовывать комплексы. Эксперименты проводили с различными типами НК.

 

Как показали результаты, самое плохое включение показывают липосомы L4. Кроме того, полученные результаты были подтверждены с помощью флуоресцентной спектроскопии.

Дли изучения способности катионных липосом переносить НК проводили трансфекцию клеток комплексами из катионных липосом и миРНК [7]. Максимальная эффективность переноса зафиксирована для липосом L2 при P/N=1/8.

По результатам проведенных исследований липосомы L2 были выбраны для проведения оптимизации получения липосомального вектора. Оптимизация проводилась по двум параметрам: время и температура озвучивания. 

Для дальнейшей оптимизации были выбраны два временных режима озвучивания - 10 и 15 мин. 

Можно сделать вывод, что хорошо воспроизводимыми образцами являются липосомы, приготовленные в режиме 15 мин при температуре 65-75 °С.

Эксперименты по доставке НК проводили при варьировании соотношения P/N. Все образцы липоплексов имели идентичную трансфицирующую активность в пределах ошибки опыта.

Были получены три образца катионных липосом и определены их физико-химические характеристики. Установлено, что липосомы L2 имеет самый меньший размер. С течением времени липосомы остаются стабильными и не агрегируют. Изучена их трансфицирующая активность и показано, что липосомы L2 способствуют наилучшей доставке миРНК в эукариотические клетки. Произведена оптимизация метода получения катионных липосом и установлены технологические параметры получения.

Используемые источники
1. A. Himanshu, P. Sitasharan, A.K Singhai, «Liposomes as drug carriers», IJPLS, vol.7, 2011, p. 945-951.
2. A. Akbarzadeh, R. Rezaei-Sadabady, «Liposome: classification, preparation, and Applications», Nanoscale Research Letters, vol. 8, 2013.
3. W. Biekle, C. Erbacher, «Nucleic acid transfection», Springer Berlin, 2010.
4. L.Y. Hwang, J.R. Solandt, C.W. Frank, «Comparison of Extruded and Sonicated Vesicles for Planar Bilayer Self-Assembly», Materials, 2013, p. 3294-3308.
5. W.G. Pitt, E.S.Richardson, D.J. Woodbury, «The Role of Ultrasound Cavitation in Liposome Size Reduction», All Faculty Publications, vol. 58, 2007.
6. Y. Zhang, «Relations between size and function of substance particles», Nano Biomed Eng, 2011, p. 1–16.
7. Y.C. Tam, S. Chen, P.R. Cullis, «Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA Delivery», Pharmaceutic, vol. 5, 2013, p. 498-507.
Information about the project
Surname Name
Luneva Anastasiya
Project title
Effective liposomal systems for delivery of next-generation drugs
Summary of the project
There are a lot of diseases caused by gene mutation. Gene therapy is one of the fast growing methods based on delivery therapeutic nucleic acids in organism. However, there are some problems with delivery nucleic acids to target cells.
The advantages of nonviral carriers are their ease preparation and scale-up, flexibility regarding the size of nucleic acids to be transferred, and safety in vivo. Despite these advantages, nonviral vectors need to be further optimized for their efficiency. Thus, cationic liposomes are perspective tool for target delivery of nucleic acids.
The aim of this research is the development and optimization of the technology of liposomal delivery system, which can be used for any type of nucleic acids. The impact process parameters on the final characteristics of the product, and its activity during the transfer of nucleic acids as well as the ability to form complexes with nucleic acids were determined. It was also important to examine the stability of the obtained cationic liposomes.
Keywords
Biotechnology, gene therapy, drug delivery systems, lipids, liposomes, transfection