Фицин - деструктор микробных биопленок

Фицин – растительная протеаза, эффективно разрушала структурные компоненты матрикса биопленок S.aureus и S.epidermidis в концентрации 10 мг/мл. Пространственную структуру биопленки анализировали при помощи атомно-силовой микроскопии. После обработки фицином, структура биопленки стала пористой, с пониженной вязкостью. Окрашивание обработанных биопленок конго красным подтвердило гидролиз белкового компонента матрикса. Кроме того, обработка биопленки фицином увеличила антимикробную эффективность ципрофлоксацина против биопленок S.aureus и S.epidermidis.

Целью работы было установить возможность применения фицина для разрушения микробных биопленок на различных поверхностях.
В соответствии с поставленной целью в работе решались следующие задачи:
1) Исследовать эффективность разрушения биопленок фицином и трипсином.
2) Установить возможность повышения эффективности антибиотика ципрофлоксацина в отношении Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis в фицина.
3) Оценить гено- и цитотоксичность фермента.

Бактерии образуют биопленки повсеместно: на подводных поверхностях природных водных систем и водопроводов, живых тканях, поверхностях зубов, медицинских устройствах и имплантатах. Действие антибиотиков, используемых в настоящее время, обладает низкой эффективностью против биопленок [Vuong et al., 2004]. Следовательно, одним из направлений в фармакологии является разработка препаратов, которые бы эффективно подавляли рост и образование ими биопленок. В настоящее время одним из подходов является покрытие поверхностей серебром или ферментами, которые разрушают матрикс биопленки. 

2.1 Штаммы:В работе использовали штаммы Staphylococcus aureus (АТСС 29213), Staphylococcus epidermidis (клинический изолят), Micrococcus luteus (клинический изолят), Pseudomonas aeruginosa (АТСС 27853), Escherichia coli (АТСС 25922), Bacillus subtilis168. Для проверки соединений на мутагенность были использованы штаммы S.typhimurium ТА 98 (hisD 3052, rfa, pKm 101, ∆uvrBbio) предоставленный НИИ по БИХС г. Купавна и Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 [OdaY etal., 1985]. Также в работе использовались раковые клетки молочной железы (MCF7) и стволовые клетки из стромально-васкулярной фракции собак, предоставленные лабораторией клеточных технологий под руководством Ризванова А.А.

2.2 Исследуемые соединения: в работе использовались ферменты: фицин и трипсин (Sigma)

2.3 ДНК-повреждающий тест:Одним из тестов на повреждение ДНК является тест на определение индукции SOS-ответа бактериальной клетки на воздействие испытуемого агента, так называемый SOS-хромотест. Для проверки испытуемых соединений ночную культуру бактерий Salmonella typhimurium TA1535/pSK1002 разводили в среде LB в 10 раз. Полученную культуральную жидкость разливали по 3 мл в пробирки и растили 4 часа в присутствии исследуемых соединений в необходимых концентрациях. Затем клетки собирали центрифугированием и определяли активность β-галактозидазы в клетках.

Также в работе использовались следующие методы: Тест Эймса [Ames, 1971], определение цитотоксичности, определение активности β-галактозидазы.

Оптимизация условий получения моно- и полимикробных биопленок в лабораторных условиях на поверхностях культуральных чашек: наиболее оптимальной была среда BM (Basal medium), успешно использованная в ранних работах [Kayumov et al., 2015, J Antibiotics; Тризна с соавт., 2015, Acta  Naturae]. Остальные среды были менее эффективными для образования биопленок.

Оценка разрушения бактериальных биопленок фицином и трипсином: Растворимый фицин разрушал биопленки всех тестируемых штаммов уже в концентрации 1 мкг/мл за исключением P.aeruginosa. Наиболее эффективно разрушались биопленки бактерий S.aureus и S.epidermidis. При этом трипсин оказывал значительно менее эффективное разрушающее действие по сравнению с фицином, несмотря на 5-кратное превышение удельной протеолитической активности на азоказеине у препарата трипсина.

Оценка количества белкового компонента матрикса биопленки при помощи окрашивания Congo Red: при добавлении фермента структура нарушается, вероятно из-за протеолиза белкового компонента матрикса под действием фицина. В результате фицин разрушал весь белковый компонент бактериальных биопленок, образованных всеми используемыми штаммами.

Исследование возможности повышения эффективности антибиотика ципрофлоксацина в отношении Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis в присутствии фицина: По причине наличия биопленки, оказывающей защитное действие, в отсутствии фермента количество мертвых клеток было незначительным. При внесении растворимого фермента наблюдалось значительное снижение количества жизнеспособных клеток, вероятно, благодаря разрушению биопленки и повышению доступности клеток бактерий для антибиотика. Таким образом, внесение фицина способствует разрушению биопленок и повышению эффективности антибиотиков.

Характеристика мутагенной и цитотоксической активности фицина: Фицин как и трипсин не демонстрировал мутагенного действия в тесте Эймса, что свидетельствует об отсутствии генотоксичности. Недостатком теста Эймса является сравнительно большое число ложных результатов, как положительных, так и отрицательных. Чтобы проверить полученные данные по мутагенности, исследовали ДНК-повреждающую активность ферментов. Полученные результаты показали, что ни одно соединение в концентрации, подавляющей образование биоплёнок у бактерий, не вызывало повышения SOS-ответа в UMU тесте, что говорит об отсутствии повреждения ДНК клеток. Ни одно из соединений не снижало активности митохондриальной дегидрагеназы, что свидетельствует об отсутствии их цитотоксичности. Также проводили микроскопирование для выявления негативного эффекта фермента на морфологию клеток на первые, вторые и третьи сутки. Ни один фермент не изменял морфологию стволовых клеток (рисунок 8) и клеток линии MCF7.

 

1)Ames, B.N. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian-microsome mutagenicity test/B.N. Ames,J. McCann, E.Yamasaki//Mutat Res. – 1975.P.347–364.
2)Oda, Y. Evaluation of the new system (umu-test) for the detectionof environmental mutagenes and carcinogens/Y.Oda,S.Nakamura, I. Oki, T.Kato, H.Shinagawa//Mutat Res. – 1985. - Р. 219–229.
3)Saising, J. Activity of gallidermin on Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms/L. Dube, A.K.Ziebandt, S.P.Voravuthikunchai, M.Nega, F.Götz//Antimicrob Agents Chemother.–2012.–P.5804–5810.
4) Vuong, C. Polysaccharide intercellular adhesin (PIA) protects Staphylococcus epidermidis against major components of the human innate immune system/J. M. Voyich, E. R. Fischer, K. R. Braughton, A. R. Whitney, F. R. DeLeo, M. Otto // Cell Microbiol.- 2004.-P.269–275.

Proteolytic enzymes are able to speed up wound healing by removal of the necrotic tissues and fibrin. Several investigations have reported that proteases damage also the microbial biofilms formed by opportunistic bacteria including Staphylococci on surfaces of chronic and acute dermal wounds. Therefore, proteases are seemingly perspective enzymes for biofilm eradication by hydrolysis of both matrix proteins and adhesins, proteins providing cells attachment onto solid surface and other bacteria, as well as by the cleavage of signalling peptides of intercellular communication of gram-positive bacteria. Here we report that ficin, a plant protease, efficiently degrades the structural components of biofilm matrix formed by S.aureus and S.epidermidis at concentrations of 10 mg/ml while trypsin and chimotrypsin are used as 1-2 mg/ml solution. The spatial structure of the biofilm was analyzed by atomic force microscopy. After ficin treatment, the biofilm structure became porous, with reduced viscosity. The congo red staining of the treated biofilms confirmed the hydrolysis of the protein component of the matrix. Moreover, the biofilm treatment with ficin increased the antimicrobial efficiency of ciprofloxacin against biofilm-embedded cells of S.aureus and S.epidermidis. While 24h antibiotic treatment did not lead to the increase of dead cells of neither S.aureus nor S.epidermidis embedded into the biofilm matrix, in the presence of ficin the fraction of viable cells decreased significantly. Accordingly, soluble ficin appears beneficial for outer wound treatment biofilm eradication and reduces the reinfection risk. The wound-healing activity of ficin requires further investigations.