Прислать материал
Разработка технологии ускоренного клонального микроразмножения цитрусовых в условиях закрытого грунта РБ
Задачи исследования:
1. Оптимизировать фитогормональный состав питательной среды для индукции морфогенного каллусогенеза в культуре C. limon (лимон), C. medica (цитрон) in vitro;
2. Выявить возможные пути морфогенеза эксплантов цитрусовых культур;
3. Оптимизировать фитогормональный состав питательной среды для индукции различных путей морфогенеза in vitro (геммо- и ризогенез) в культуре C. limon, C. medica in vitro;
4. Провести RAPD-PCR для выявления маркеров межсортовых различий сортов видов C. limon, C. medica, C. sinensis (апельсин об.), C. paradisi (грейпфрут об.).
Актуальность проблемы. В учебно-опытном хозяйстве ГБОУ СПО «Уфимский лесхоз-техникум» («Лимонарий»), к.б.н. Садыковой Ф.В., являющейся заведующим данного хозяйства, выведено несколько уникальных сортов лимона и цитрона, размножение которых вегетативным путем затруднено.
В настоящее время наиболее эффективным способом их коммерческого воспроизводства и одним из путей сохранения растительного биоразнообразия является метод микроразмножения растений в культуре изолированных тканей.
Для изучения процессов морфогенеза в качестве исходного материала были взяты сегменты побегов длиной 0,5 см с пазушной почкой сортов C. limon: Ташкентский (Фахритдинов-1), Юбилейный (Фахритдинов-2), Салават, Лейсан, Урман и C. medica: Павловский, Уралтау, Зиля и Рука Будды (Садыкова, 2009). Для более детального изучения межсортовых и межвидовых отличий в качестве материала были взяты образцы ДНК сортов лимона и цитрона, а также C. sinensis (Апельсина об.) и C. paradisi (Грейпфрута об.), любезно предоставленные руководителем Учебно-опытного хозяйства ГБОУ СПО «Уфимский лесхоз-техникум» («Лимонарий») Садыковой Ф.В.
Высаженный материал культивировался при естественном освещении при 22 - 24°C и относительной влажности 70-80 %.
Оптимизацию концентрации фитогормонов для культивирования проводили методом подбора различных концентраций фитогормонов: в качестве цитокинина использовали 6 – бензиламинопурин (6-БАП), в качестве ауксинов – индолилуксусную (ИУК), нафтилуксусную и 2,4 – дихлофеноксиуксусную (2,4-Д) кислоты.
Выделение тотальной ДНК из растительного материала проводили методом солевой экстракции (Бокуть и др., 2005)
Для выявления генетического разнообразия исследуемых представителей рода Citrus в работе использовали RAPD-PCR.
Амплифицированные фрагменты фракционировали в 1,0 % агарозных гелях, которые окрашивали бромистым этидием.
Было опробовано 25 вариантов питательной среды МС для каждого сорта, различающихся по концентрации ИУК/6-БАП, 2,4-Д/6-БАП.
Среди проанализированных вариантов питательных сред эмпирическим путем были выявлены оптимальные соотношения фитогормонов для индукции каллусогенеза и морфогенеза культуре in vitro.
Полученные экспериментальные данные свидетельствует о разной реакции сортов цитрона на культивирование in vitro.
Для проведения RAPD-PCR было использовано 10 праймеров и проанализировано 11 образцов ДНК с целью получения молекулярных спектров амплифицированных ДНК-спектров для изучения генетической изменчивости сортов C. limon, C. medica, C. paradisi (Грейпфрут об), C. sinensis (Апельсин об.).
Наибольшую эффективность при выявлении видового и сортового полиморфизма продемонстрировали праймеры, у которых доля полиморфных фрагментов, детектированных с их помощью, составляет 50% и выше.
Таким образом, нами подобрана комбинация RAPD-праймеров (PKF; PIP1), позволяющие получать полиморфные ДНК-спектры для представителей рода Citrus, наиболее широко используемых в отечественной селекции. С помощью предложенной комбинации можно дифференцировать генотипы всех 11-ти изученных образцов. Для каждого образца получены специфичные спектры фрагментов амплификации, которые при дальнейшей разработке могут быть преобразованы в сортоспецифичные/видоспецифичные монолокусные ДНК-маркеры.
1. Бокуть С.Б., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Молекулярная биология. Минск: Вышейшая школа, 2005. – С. 392-437.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие.- М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.- 160 с.
3. Садыкова Ф. В. Опыт выращивания лимонов в Башкортостане. - Уфа, 2009. - 63 с.
4. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. - Учебник. М.: Высшая школа, 2003. - 469 с.
5. Crockett P.A., Bhalla P.L., Lee C.K., Singh M.B. RAPD analysis of seed purity in a commercial hybrid cabbage (Brassica oleracea var. capitata) cultivar. Genome, 2000, 43: 317-321.
6. Tingey S. Genetic analysis with RAPD markers / S. Tingey, J. Rafalski, J. Williams // Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. - Ed. M. Neff., 1992. - P. 1-6.