Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка технологии ускоренного клонального микроразмножения цитрусовых в условиях закрытого грунта РБ

Сведения об участнике
ФИО
Филиппова Дарья Сергеевна
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный педагогический университет им.М.Акмуллы»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Агро-, био- и производственные технологии
Раздел области наук
Земледелие и растениеводство
Тема
Разработка технологии ускоренного клонального микроразмножения цитрусовых в условиях закрытого грунта РБ
Резюме
Рассмотрены особенности культивирования in vitro сортов C. limon, C. medica. Оптимизирован фитогормональный состав питательной среды МС для каллусогенеза и морфогенеза. Для более детального изучения межсортовых и межвидовых отличий в качестве материала были взяты образцы ДНК сортов лимона и цитрона, а также Апельсина об. и Грейпфрута об.
Ключевые слова
культура in vitro, оптимизация состава сред, C. limon, C. medica, эксплант, питательная среда, фитогормоны, индолилуксусная кислота (ИУК), 6-бензиламинопурин (6-БАП), RAPD-PCR.
Цели и задачи
Цель исследования: разработать технологии ускоренного клонального микроразмножения цитрусовых в условиях закрытого грунта РБ для сохранения и распространения
Задачи исследования:
1. Оптимизировать фитогормональный состав питательной среды для индукции морфогенного каллусогенеза в культуре C. limon (лимон), C. medica (цитрон) in vitro;
2. Выявить возможные пути морфогенеза эксплантов цитрусовых культур;
3. Оптимизировать фитогормональный состав питательной среды для индукции различных путей морфогенеза in vitro (геммо- и ризогенез) в культуре C. limon, C. medica in vitro;
4. Провести RAPD-PCR для выявления маркеров межсортовых различий сортов видов C. limon, C. medica, C. sinensis (апельсин об.), C. paradisi (грейпфрут об.).
Введение

Актуальность проблемы. В учебно-опытном хозяйстве ГБОУ СПО «Уфимский лесхоз-техникум» («Лимонарий»), к.б.н. Садыковой Ф.В., являющейся заведующим данного хозяйства, выведено несколько уникальных сортов лимона и цитрона, размножение которых вегетативным путем затруднено.

В настоящее время наиболее эффективным способом их коммерческого воспроизводства и одним из путей сохранения растительного биоразнообразия является  метод микроразмножения растений в культуре изолированных тканей.

 

 

Методы и материалы

Для изучения процессов морфогенеза в качестве исходного материала были взяты сегменты побегов длиной 0,5 см с пазушной почкой сортов C. limon: Ташкентский (Фахритдинов-1), Юбилейный (Фахритдинов-2), Салават, Лейсан, Урман и C. medica: Павловский, Уралтау, Зиля и Рука Будды (Садыкова, 2009). Для более детального изучения межсортовых и межвидовых  отличий в качестве материала были взяты образцы ДНК сортов лимона и цитрона, а также C. sinensis (Апельсина об.) и C. paradisi (Грейпфрута об.), любезно предоставленные руководителем Учебно-опытного хозяйства ГБОУ СПО «Уфимский лесхоз-техникум» («Лимонарий») Садыковой Ф.В.

Высаженный материал культивировался при естественном освещении при 22 - 24°C и относительной влажности 70-80 %.

Оптимизацию концентрации фитогормонов для культивирования проводили методом подбора различных концентраций фитогормонов: в качестве цитокинина использовали 6 – бензиламинопурин (6-БАП), в качестве ауксинов – индолилуксусную (ИУК), нафтилуксусную и 2,4 – дихлофеноксиуксусную (2,4-Д) кислоты.

Выделение тотальной ДНК из растительного материала проводили методом солевой экстракции (Бокуть и др., 2005)

Для выявления генетического разнообразия исследуемых представителей рода Citrus в работе использовали RAPD-PCR.

Амплифицированные фрагменты фракционировали в 1,0 % агарозных гелях, которые окрашивали бромистым этидием. 

Описание и обсуждение результатов

Было опробовано 25 вариантов питательной среды МС для каждого сорта, различающихся по концентрации ИУК/6-БАП, 2,4-Д/6-БАП.

Среди проанализированных вариантов питательных сред эмпирическим путем были выявлены оптимальные соотношения фитогормонов для индукции каллусогенеза и морфогенеза культуре in vitro.

Полученные экспериментальные данные свидетельствует о разной реакции сортов цитрона на культивирование in vitro.

Для проведения RAPD-PCR было использовано 10 праймеров и проанализировано 11 образцов ДНК с целью получения молекулярных спектров амплифицированных ДНК-спектров для изучения генетической изменчивости сортов C. limon, C. medica, C. paradisi (Грейпфрут об), C. sinensis (Апельсин об.).

Наибольшую эффективность при выявлении видового и сортового полиморфизма продемонстрировали праймеры, у которых доля полиморфных фрагментов, детектированных с их помощью, составляет 50% и выше.

Таким образом, нами подобрана комбинация RAPD-праймеров (PKF; PIP1), позволяющие получать полиморфные ДНК-спектры для представителей рода Citrus, наиболее широко используемых в отечественной селекции. С помощью предложенной комбинации можно дифференцировать генотипы всех 11-ти изученных образцов. Для каждого образца получены специфичные спектры фрагментов амплификации, которые при дальнейшей разработке могут быть преобразованы в сортоспецифичные/видоспецифичные монолокусные ДНК-маркеры.

Используемые источники
ЛИТЕРАТУРА
1. Бокуть С.Б., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Молекулярная биология. Минск: Вышейшая школа, 2005. – С. 392-437.
2. Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: Учеб. пособие.- М.: ФБК-ПРЕСС, 1999.- 160 с.
3. Садыкова Ф. В. Опыт выращивания лимонов в Башкортостане. - Уфа, 2009. - 63 с.
4. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. - Учебник. М.: Высшая школа, 2003. - 469 с.
5. Crockett P.A., Bhalla P.L., Lee C.K., Singh M.B. RAPD analysis of seed purity in a commercial hybrid cabbage (Brassica oleracea var. capitata) cultivar. Genome, 2000, 43: 317-321.
6. Tingey S. Genetic analysis with RAPD markers / S. Tingey, J. Rafalski, J. Williams // Applications of RAPD Technology to Plant Breeding. - Ed. M. Neff., 1992. - P. 1-6.
Information about the project
Surname Name
Filippova Daria
Project title
Development of technology for the accelerated clonal micropropagation of citrus in greenhouses RB
Summary of the project
The features of the in vitro cultivation of varieties of C. limon, C. medica. Optimized phytohormonal composition of the nutrient medium MS for callusogenesis and morphogenesis. For a more detailed study of intervarietal and interspecific differences in the quality of the material was taken DNA samples of varieties of lemon and citron, and Orange. and Grapefruit about
Keywords
in vitro culture, optimization of medium composition, C. limon, C. medica, Explant, nutrient medium, plant hormones, indoleacetic acid, 6-benzylaminopurine, RAPD-PCR.