Регистрация / Вход
Прислать материал

"Лактобациллы как основа пробиотиков и продуктов функционального питания для восстановления микробиоты человека после радиоактивного облучения"

Сведения об участнике
ФИО
До Тхи Зуен
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Агро-, био- и производственные технологии
Раздел области наук
Теоретические основы и технология пищевых продуктов
Тема
"Лактобациллы как основа пробиотиков и продуктов функционального питания для восстановления микробиоты человека после радиоактивного облучения"
Резюме
В данном проекте впервые исследовано влияние медицинского рентгенодиагностического облучения на их штаммы, выделенные нами из различных источников и охарактеризованные с позиций использования в пробиотикотерапии. Показано, что рентгеновских процедур не влияют на жизнеспособность лактобацилл пяти разных видов (L. plantarum, L. rhamnosus, и д.р.) и образование у них АФК. Методом ПЦР и секвенирования ДНК впервые выполнено определение радиорезистентных генов в геномах исследуемых лактобацилл. Результаты исследования - основа научно обоснованной разработки эффективных бактериальных препаратов для восстановления нормофлоры кишечника человека после радиоактивного поражения.
Ключевые слова
Лактобациллы; пробиотические свойства; медицинское облучение; рентгенорадиологическое исследование; выживаемость; пероксид водорода; гены радиорезистентности
Цели и задачи
Целью проекта является скрининг пробиотически активных и радиорезистентных штаммов лактобацилл.
В ходе выполнения проекта решаются следующие основные задачи:

1) Выделение представителей рода Lactobacillus из различных источников (кисломолочных продуктов, кишечника человека, силоса и других продуктов растительного происхождения);

2) Видовая идентификация бактерий на основе культуральных, морфологических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических свойств.

3) Оценка соответствия штаммов лактобацилл основным требованиям, предъявляемым к пробитическим бактериям: (а) устойчивость к инактивирующим факторам желудочно-кишечного тракта; (б) антагонистическая активность в отношении патогенных микроорганизмов; (в) адгезивная активность; (г) антибиотикорезистентность;

4) Характеристика влияния основных медицинских рентгенорадиологических исследований (флюорография, рентгенография, компьютерная томография, маммография) на выживаемость лактобацилл разных видов и образование у них АФК;

5) Экспериментальное определение генов радиорезистентности recN, recF, recG, urvA, urvB в геномах исследуемых лактобацилл.
Введение

В литературе практически отсутствуют данные о влиянии ионизирующего облучения на чистые культуры лактобацилл. Исследования влияния медицинских рентгенодиагностических процедур на бактерии рода Lactobacillus ранее не проводились.Данный проект нацелен на поиск пробиотически активных, радиорезистентных штаммов лактобацилл. В этой связи предлагается выделить лактобациллы из мест их обитания, исследовать пробиотические свойства и устойчивость штаммов к ионизирующему излучению. Решение поставленных в проекте задач сделает возможным создание пробиотических препаратов нового поколения и кисломолочных продуктов функционального питания, предназначенных для восстановления микробиоты человека после радиоактивного облучения.

Методы и материалы

- Выделение лактобацилл выполнено методами классической микробиологии. Определение принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus проводилось по ГОСТ 10444.11-89.

- Видовая принадлежность лактобацилл установлена с помощью молекулярно-биологических методов: секвенирования гена 16S рРНК и масс-спектрометрии MALDI-TOF. У всех использованных штаммов охарактеризованы морфологические и культуральные свойства, для чего применялись классические микробиологические методы и световая микроскопия.

- Для оценки антагонистической активности лактобацилл использовался метод агаровых дисков. В качестве тест-объектов использовались (условно-)патогенные бактерии. Оценена выживаемость лактобацилл в жидкостях, имитирующих желудочное и кишечное содержимое. Адгезивность клеток оценена по адгезии на н-гексадекане. Определена устойчивость лактобацилл к антибиотикам различной природы диско-диффузионным методом.

- Оценка жизнеспособности бактерий проводилась с помощью окрашивания йодидом пропидия (PI) и последующей проточной цитофлуориметрии (BD FACS Canto II, США), а также высевом на чашки Петри и подсчетом колоний.

- Пероксид водорода определен качественно с помощью 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина и количественно – с помощью колориметрического метода.

- Анализ генетических детерминант в геномах лактобацилл выполнен методом ПЦР. Секвенирование полученных фрагментов ДНК выполнено на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ.

Описание и обсуждение результатов

В ходе работ по проекту из кисломолочных продуктов, пробиотических препаратов, фекалий человека, растительного материала (силоса, квашеной и свежей капусты, соленых огурцов) выделены 18 штаммов микроорганизмов и установлена их принадлежность к роду Lactobacillus, согласно ГОСТ 10444.11-89 и прямому белковому профилированию MALDI-TOF. У выделенных штаммов лактобацилл охарактеризованы основные пробиотические свойства: устойчивость к инактивирующим факторам ЖКТ (симулированному желудочному соку) и адгезивная активность по адгезии на гексадекане, а также получены спектры резистентности к клинически значимым антибиотикам. У штаммов Lactobacillus sp. FCa 1L, L. plantarum FCa 3L, Lplantarum S6 и L. plantarum S7 методом агаровых блоков установлен широкий спектр антимикробного действия. С целью выяснить природу антагонистической активности у исследуемых лактобацилл определены метаболиты, обладающие бактерицидным/бактериостатическим действием: бактериоцины, пероксид водорода и кислоты. Кислотообразующая активность охарактеризована по скорости закисления среды при росте на ней лактобацилл.

Впервые показано, что основные медицинские рентгенорадиологические исследования (флюорография, рентгенография, компьютерная томография, маммография) не снижают жизнеспособность лактобацилл Lplantarum, Lrhamnosus, Lfermentum, L. helveticus, Lacidophilus, выделенных из пробиотических препаратов и ЖКТ человека, а также не оказывают значимое влияние на образование АФК в клетках лактобацилл. Методом ПЦР в геномах исследуемых лактобацилл проверено наличие пяти основных генов, обеспечивающих радиорезистентность бактерий. Последовательности продуктов ПЦР-амплификации просеквенированы. Ген recG, кодирующий АТФ-зависимую ДНК хеликазу RecG, обнаружен во всех 12 штаммах. У отдельных штаммов обнаружены гены системы репарации UvrABC urvА и urvВ и гены рекомбинационной репарации recF и recN. У одного штамма (L. fermentum Na) присутствуют все пять исследуемых генов.

Таким образом, в ходе работ по проекту была создана коллекция изолятов лактобацилл и выполнена предварительная оценка их соответствия основным критериям пробиотической активности: наличие антагонистической активности, способность выживать в ЖКТ и колонизировать его. К дозам облучения, используемым в лучевой диагностике, все исследуемые лактобациллы проявили резистентность. В ходе продолжения работ по тематике данного проекта будут использованы более высокие дозы ИИ (в частности, используемые при лучевой терапии в онкологии), что позволит проводить отбор радиорезистентных штаммов лактобацилл.

Подготовленная фундаментальная научная база может быть использована в биомедицине для создания новых и совершенствования существующих пробиотиков и продуктов функционального питания на основе лактобацилл.

Используемые источники
1) Ленцнер А. А. Лактофлора и колонизационная резистентность [Текст] / А. А. Ленцнер, Х. П. Ленцнер, М. Э. Микельсаар // Антибиотики и медицинская биотехнология. – 1987. – Т. 32. – С. 173 – 179.
2) Репин, В.С Дозы облучения населения Российской Федерации в 2013 году: информационный сборник / В.С. Репин, Н.К.Барышков, А.А. Братилова [и др.] – СПб. –2014. – 60 с.
3) Соловьева И. В. Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus [Текст] / И. В. Соловьева и др. // Общая биология. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2010. – № 2. с. 462–468.
4) Byrne, R. T. Surviving extreme exposure to ionizing radiation: Escherichia coli genes and pathways [Text] / R. T. Byrne, S. H. Chen, E. A. Wood, E. L. Cabot, M. M. Cox // Journal of Bacteriology. – 2014. – 33р.
Information about the project
Surname Name
DO
Project title
Lactobacillus as a basis probiotics and products of a functional nutrition for restoration of human intestinal flora after irradiating
Summary of the project
We aimed to identify effects of diagnostic medical irradiation on various Lactobacillus strains(L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum, L. helveticus, L. acidophilus), extracted by us from various sources ( faeces of human and vegetable sources) and characterized from positions of uses in probiotic-therapy. It was shown that diagnostical irradiation do not have influence on viability of five different Lactobacillus strains and on their potential formation ROS. Method PCR and sequences DNA in the first time was used for identification irradiant-resistance genes in genomes of these Lactobacillus. These new findings maybe bring us potential in producing new bacterials drugs, using for restoration human intestinal flora after irradiating.
Keywords
Lactobacillus; PCR; ROS; Prebiotics