Прислать материал
"Лактобациллы как основа пробиотиков и продуктов функционального питания для восстановления микробиоты человека после радиоактивного облучения"
В ходе выполнения проекта решаются следующие основные задачи:
1) Выделение представителей рода Lactobacillus из различных источников (кисломолочных продуктов, кишечника человека, силоса и других продуктов растительного происхождения);
2) Видовая идентификация бактерий на основе культуральных, морфологических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических свойств.
3) Оценка соответствия штаммов лактобацилл основным требованиям, предъявляемым к пробитическим бактериям: (а) устойчивость к инактивирующим факторам желудочно-кишечного тракта; (б) антагонистическая активность в отношении патогенных микроорганизмов; (в) адгезивная активность; (г) антибиотикорезистентность;
4) Характеристика влияния основных медицинских рентгенорадиологических исследований (флюорография, рентгенография, компьютерная томография, маммография) на выживаемость лактобацилл разных видов и образование у них АФК;
5) Экспериментальное определение генов радиорезистентности recN, recF, recG, urvA, urvB в геномах исследуемых лактобацилл.
В литературе практически отсутствуют данные о влиянии ионизирующего облучения на чистые культуры лактобацилл. Исследования влияния медицинских рентгенодиагностических процедур на бактерии рода Lactobacillus ранее не проводились.Данный проект нацелен на поиск пробиотически активных, радиорезистентных штаммов лактобацилл. В этой связи предлагается выделить лактобациллы из мест их обитания, исследовать пробиотические свойства и устойчивость штаммов к ионизирующему излучению. Решение поставленных в проекте задач сделает возможным создание пробиотических препаратов нового поколения и кисломолочных продуктов функционального питания, предназначенных для восстановления микробиоты человека после радиоактивного облучения.
- Выделение лактобацилл выполнено методами классической микробиологии. Определение принадлежности выделенных бактерий к роду Lactobacillus проводилось по ГОСТ 10444.11-89.
- Видовая принадлежность лактобацилл установлена с помощью молекулярно-биологических методов: секвенирования гена 16S рРНК и масс-спектрометрии MALDI-TOF. У всех использованных штаммов охарактеризованы морфологические и культуральные свойства, для чего применялись классические микробиологические методы и световая микроскопия.
- Для оценки антагонистической активности лактобацилл использовался метод агаровых дисков. В качестве тест-объектов использовались (условно-)патогенные бактерии. Оценена выживаемость лактобацилл в жидкостях, имитирующих желудочное и кишечное содержимое. Адгезивность клеток оценена по адгезии на н-гексадекане. Определена устойчивость лактобацилл к антибиотикам различной природы диско-диффузионным методом.
- Оценка жизнеспособности бактерий проводилась с помощью окрашивания йодидом пропидия (PI) и последующей проточной цитофлуориметрии (BD FACS Canto II, США), а также высевом на чашки Петри и подсчетом колоний.
- Пероксид водорода определен качественно с помощью 3,3’,5,5’-тетраметилбензидина и количественно – с помощью колориметрического метода.
- Анализ генетических детерминант в геномах лактобацилл выполнен методом ПЦР. Секвенирование полученных фрагментов ДНК выполнено на оборудовании Междисциплинарного центра коллективного пользования КФУ.
В ходе работ по проекту из кисломолочных продуктов, пробиотических препаратов, фекалий человека, растительного материала (силоса, квашеной и свежей капусты, соленых огурцов) выделены 18 штаммов микроорганизмов и установлена их принадлежность к роду Lactobacillus, согласно ГОСТ 10444.11-89 и прямому белковому профилированию MALDI-TOF. У выделенных штаммов лактобацилл охарактеризованы основные пробиотические свойства: устойчивость к инактивирующим факторам ЖКТ (симулированному желудочному соку) и адгезивная активность по адгезии на гексадекане, а также получены спектры резистентности к клинически значимым антибиотикам. У штаммов Lactobacillus sp. FCa 1L, L. plantarum FCa 3L, L. plantarum S6 и L. plantarum S7 методом агаровых блоков установлен широкий спектр антимикробного действия. С целью выяснить природу антагонистической активности у исследуемых лактобацилл определены метаболиты, обладающие бактерицидным/бактериостатическим действием: бактериоцины, пероксид водорода и кислоты. Кислотообразующая активность охарактеризована по скорости закисления среды при росте на ней лактобацилл.
Впервые показано, что основные медицинские рентгенорадиологические исследования (флюорография, рентгенография, компьютерная томография, маммография) не снижают жизнеспособность лактобацилл L. plantarum, L. rhamnosus, L. fermentum, L. helveticus, L. acidophilus, выделенных из пробиотических препаратов и ЖКТ человека, а также не оказывают значимое влияние на образование АФК в клетках лактобацилл. Методом ПЦР в геномах исследуемых лактобацилл проверено наличие пяти основных генов, обеспечивающих радиорезистентность бактерий. Последовательности продуктов ПЦР-амплификации просеквенированы. Ген recG, кодирующий АТФ-зависимую ДНК хеликазу RecG, обнаружен во всех 12 штаммах. У отдельных штаммов обнаружены гены системы репарации UvrABC urvА и urvВ и гены рекомбинационной репарации recF и recN. У одного штамма (L. fermentum Na) присутствуют все пять исследуемых генов.
Таким образом, в ходе работ по проекту была создана коллекция изолятов лактобацилл и выполнена предварительная оценка их соответствия основным критериям пробиотической активности: наличие антагонистической активности, способность выживать в ЖКТ и колонизировать его. К дозам облучения, используемым в лучевой диагностике, все исследуемые лактобациллы проявили резистентность. В ходе продолжения работ по тематике данного проекта будут использованы более высокие дозы ИИ (в частности, используемые при лучевой терапии в онкологии), что позволит проводить отбор радиорезистентных штаммов лактобацилл.
Подготовленная фундаментальная научная база может быть использована в биомедицине для создания новых и совершенствования существующих пробиотиков и продуктов функционального питания на основе лактобацилл.
2) Репин, В.С Дозы облучения населения Российской Федерации в 2013 году: информационный сборник / В.С. Репин, Н.К.Барышков, А.А. Братилова [и др.] – СПб. –2014. – 60 с.
3) Соловьева И. В. Изучение биологических свойств новых штаммов рода Lactobacillus [Текст] / И. В. Соловьева и др. // Общая биология. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. – 2010. – № 2. с. 462–468.
4) Byrne, R. T. Surviving extreme exposure to ionizing radiation: Escherichia coli genes and pathways [Text] / R. T. Byrne, S. H. Chen, E. A. Wood, E. L. Cabot, M. M. Cox // Journal of Bacteriology. – 2014. – 33р.