Регистрация / Вход
Прислать материал

Биоинформационный поиск новых лакказ у актинобактерий

Сведения об участнике
ФИО
Конев Александр Игоревич
Вуз
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный национальный исследовательский университет»
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Биоинформационный поиск новых лакказ у актинобактерий
Резюме
Анализ генома актинобактерии Rhodococcus ruber ИЭГМ 231 выявил наличие двух генов, кодирующих лакказы, и четырех генов вероятных полимедных оксидаз. Экспериментально подтверждена лакказная активность данного штамма. Оценена in silico внутриродовая гомология доменной структуры полимедных оксидаз родококков, варьирующая от низкого (30%) до высокого (85%) уровня. На основе филогенетического анализа выделено 4 кластера полимедных оксидаз Rhodococcus spp. с разной степенью гетерогенности (усл. расстояние от 0,6 до 1,9) и подтверждена филогенетическая обособленность двух лакказ из R. ruber. Результаты будут востребованы при разработке новых бактериальных лакказ для биотехнологии.
Ключевые слова
Лакказы, полифенолы, Rhodococcus, филогенетика
Цели и задачи
Цель работы – изучить генетическую организацию лакказ у родококков и оценить их внутриродовую гомологию. Задачи включали: (1) биоинформационный поиск лакказных генов в геноме R. ruber ИЭГМ 231; (2) анализ структурных доменов выявленных последовательностей лакказ; (3) филогенетический анализ полимедных оксидаз; (4) оценку лакказной активности родококков.
Введение

Лакказы (КФ 1.10.3.2) – полифенольные оксидазы, катализирующие окисление разнообразных органических соединений. Поиск бактериальных лакказ актуален из-за их более высокой активности при повышенной температуре и щелочных условиях по сравнению с грибными ферментами [1]. Актинобактерии рода Rhodococcus являются перспективными источниками новых ферментов для биотехнологии. Сравнительно недавно, в нашей лаборатории был секвенирован полный геном штамма R. ruber ИЭГМ 231 [2], что позволило провести направленный поиск лакказных генов у родококков.

Методы и материалы

В работе использовали последовательность генома штамма R. ruber ИЭГМ 231, депонированную в базах данных MicroScope (https://www.genoscope.cns.fr/agc/microscope/home/index.php) и NCBI GenBank. Анализ доменной структуры полимедных оксидаз у R. ruber проведен с использованием программного обеспечения NCBI BLAST. Детальный анализ депонированных последовательностей полимедных оксидаз родококков выполнен с использованием программы  BLAST, а именно при помощи алгоритма поиска консервативных доменов. Филогенетический анализ полимедных оксидаз проводили путем множественных выравниваний аминокислотных последовательностей при помощи алгоритмов MUSCLE [3]. После выравнивания последовательностей неоднозначные регионы удаляли при помощи редактора последовательностей в ПО Unipro UGENE (v1.22.0). Филогенетическое дерево построено с помощью метода максимального правдоподобия с использованием ПО PHYLIP (программа PhyML; алгоритм аLRT) (v3.695) [4]. Степень доверия внутренним ветвям оценивали с помощью метода бутстрэп (на основании 100 сгенерированных выборок). Графическое представление филогенетического дерева реализовано с использованием ПО UGENE. Для анализа использовали последовательности полимедных оксидаз родококков с доменной структурой, гомологичной последовательностям R. ruber ИЭГМ 231. Экспериментальное подтверждение лакказной активности у родококков проводили качественным тестом на окисление лакказного субстрата ABTS.

Описание и обсуждение результатов

В результате анализа генома штамма R. ruber ИЭГМ 231 выявлено наличие мультигенного семейства лакказ, обнаружены два гена полимедных оксидаз третьего типа: RHRU231v1_660030 и RHRU231v1_850023, четыре гена предполагаемых полимедных оксидаз RHRU231v1_620027, RHRU231v1_470119, RHRU231v1_480098 и RHRU231v1_760007. Экспериментально подтверждена лакказная активность данного штамма. Выявлено наличие следующих структурных доменов полимедных оксидаз: RHRU231v1_660030: CuRO_1_Tth-MCO_like, CuRO_3_Tth-MCO_like, Cupredoxin super family, SufI; RHRU231v1_620027: CuRO_1_Tth-MCO_like, CuRO_3_Tth-MCO_like, Cupredoxin super family, SufI; RHRU231v1_850023: CuRO_3_CopA, CuRO_2_CopA_like_1, CuRO_1_CumA_like, SufI; RHRU231v1_760007: CuRO_1_CumA_like, CuRO_3_CopA, Cupredoxin super family, SufI; RHRU231v1_470119: CuRO_1_CueO_FtsP, CuRO_2_CueO_FtsP, CuRO_3_CueO_FtsP, ascorbOXfungal; RHRU231v1_480098: YfiH. В результате биоинформационного анализа установлено, что для других видов родококков характерно наличие полимедных оксидаз с аналогичной доменной структурой. Так, лакказные домены CuRO_1_Tth-MCO_like и CuRO_3_Tth-MCO_like обнаружены в последовательностях представителей R. erythropolis, R. jostii, R. opacus и R. rhodochrous. Анализ гомологии полимедных оксидаз из R. ruber ИЭГМ 231 и аналогичных последовательностей других видов родококков показал, что для последовательностей RHRU231v1_480098 и RHRU231v1_760007 характерно наибольшее (71-85%) сходство. Менее выраженное сходство отмечено для последовательностей RHRU231v1_470119 (47-66%) и RHRU231v1_850023 (около 50%), а наиболее низкое (30-52%) – для RHRU231v1_660030 и RHRU231v1_620027.

Филогенетическое дерево выявило 4 кластера, при этом полимедные оксидазы, вошедшие в кластеры 1 и 2, имеют аналогичные домены с последовательностями RHRU231v1_470119. Исходя из структуры доменов, это полимедные оксидазы, отвечающие за резистентность бактерий к ионам меди и учавствующие в делении клетки. Кластер 3 сформирован полимедными оксидазами, имеющими сходные домены с RHRU231v1_850023. Данные полимедные оксидазы выполняют различные клеточные функции и, возможно, также участвуют в формировании резистентности бактерий к ионам меди. В кластер 4 вошли полимедные оксидазы с доменной структурой, аналогичной RHRU231v1_760007, и имеющие высокую степень сходства с последовательностями из кластера 3. Филогенетический анализ подтвердил обособленность последовательностей вероятных лакказ RHRU231v1_620027; RHRU231v1_660030 из R. ruber ИЭГМ 231, свидетельствующую об их возможной функциональной уникальности и более ранней эволюционной дивергенции.

Используемые источники
1. Sharma, P. Bacterial laccases / P. Sharma, R. Goel, N. Capalash // World J. Microbiol. Biotechnol. – 2007. – V. 23. – P. 823-832.
2. Draft genome sequence of propane- and butane-oxidizing actinobacterium Rhodococcus ruber IEGM 231 / I.B. Ivshina [et al.] // Genome Announcements. – 2014. – V. 2, N. 6. – e01297-14.
3. Edgar, R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput / R.C. Edgar // Nucleic Acids Res. – 2004. – V. 32. – P. 1792-1797.
4. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: Assessing the performance of PhyML 3.0 / S. Guindon [et al.] // Syst. Biol. – 2010. – V. 59. – P. 307-321.

Information about the project
Surname Name
Konev Alexsander
Project title
Bioinformatic search of new lacсases from actinobacteria
Summary of the project
Analysis of the genome of actinobacteria Rhodococcus ruber IEGM 231 revealed the presence of two genes encoding laccases, and four genes likely multicopper oxidases. laccase activity of this strain was experimentally confirmed. Estimated in silico inside generic homology of the domain structure multicopper oxidases from Rhodococcus, varies from low (30%) to high (85%) level. Based on phylogenetic analysis identified 4 clusters multicopper oxidases from Rhodococcus spp. with varying degrees of heterogeneity (conditional distance from 0.6 to 1.9) and confirmed by phylogenetic isolation of two laccases from R. ruber. Results will be demand in the development of new bacterial laccases for biotechnology.
Keywords
Laccases, a polyphenols, Rhodococcus, phylogenetics