Регистрация / Вход
Прислать материал

Структурно-функциональный анализ бактериальных HU-белков

Сведения об участнике
ФИО
Агапова Юлия Константиновна
Вуз
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский физико-технический институт (государственный университет)"
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Структурно-функциональный анализ бактериальных HU-белков
Резюме
HU белки являются наиболее распространенными ДНК-связывающими белками в прокариотических организмах и играют важную роль в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Сравнение пространственной укладки HUSpm с бактериальными гомологами показало, что их структуры весьма схожи. В то же время согласно данным ДСК, HUSpm отличается высокой температурой тепловой денатурации (76 градусов по Цельсию). С целью выяснения структурных особенностей HUSpm, ответственных за высокую термостабильность белка, был проведен детальный анализ его структуры, который позволил выявить факторы, ответственные за необычные термостабильные характеристики белка.
Ключевые слова
HU белки, ДНК-связывание, термостабильность, гидрофобное ядро, Spiroplasma melliferum
Цели и задачи
Цель данной работы состояла в выявлении структурных особенностей HUSpm, ответственных за высокую термостабильность белка. Для этого сначала был проведен детальный анализ структуры HUSpm, который позволил выявить факторы, потенциально ответственные за необычные термостабильные характеристики белка. После чего, был осуществлён направленный точечный мутагенез белка, с последующим определением влияния мутаций на температуру плавления молекулы, что позволило подтвердить или опровергнуть вклад каждой из вышеперечисленных структурных особенностей HUSpm в термостабильность белка.

Введение

В бактериях белки, ассоциированные с нуклеотидом (NAPs – nucleoid associated proteis), представляют одну из самых больших групп регуляторов, которые контролируют уплотнение генома, хромосомную архитектуру и различные виды операций, связанных с ДНК. Особую роль среди NAPs играет гистоноподобный белок HU, который присутствует абсолютно во всех бактериях и является самым высококопийным ДНК связывающим белком. 

HU белки - это небольшие (ММ около 10 кДа) положительно заряженные белки, образующие гомо или гетеродимеры. Небольшой размер и высокий уровень сходства первичной и пространственной структуры HU белков делают их удобным объектом для изучения зависимости функциональных особенностей макромолекулы от её структуры.

Методы и материалы

Мутагенез “quick change” с использованием одного праймера

Праймер состоит из левого плеча длиной 15-18 п.о., полностью соответствующего последовательности расположенной в 5'-области от мутируемого участка, далее идет мутируемый участоки правое плечо 15-18 п.о. 

С заказанного праймера синтезируется новая цепь по всей длине плазмидной матрицы с помощью термостабильной полимеразы, обладающей корректирующей 3'->5' экзонуклеазной активностью (Tersus, Евроген).

Метод анализа изменения электрофоретической подвижности

Акриламидный гель для EMSA анализа приготавливался по стандартной методике, используемой для заливки гелей для электрофореза по Лэммли.

Для постановки EMSA смешивали в соответствующих концентрациях с 5 pmol белка и 5 pmol олигонуклеотида до объема 8 мкл. В полученную смесь добавляли 2 мкл буфера для образцов и наносили на 15% неденатурирующий акриламидный гель.

Электрофорез проводили на напряжении 200В при температуре 4оС.

Дифференциально сканирующая каллометрия

Измерение избыточной теплоёмкости денатурации белка проводили в дифференциальном адиабатическом микрокалориметре ДАСМ-4М с капиллярными ячейками объёмом 467 мкл при давлении в ячейках 2,2 атмосферы и скорости нагрева 1 K/min.

Для эксперимента использовался белок в концентрациях 1,0 и 4.5 мг/мл, находящийся в буфере, содержащем 10 mM sodium phosphate (pH 7.4) и 0.2 M NaCl (или 1.0 M NaCl для проверки влияния концентрации соли на процесс тепловой денатурации белка).

 

Описание и обсуждение результатов

Были выделенны ключевые структурные факторы, ответственные за высокую термостабильность HUSpm – неконсервативные Phe14 и Phe29, укрепляющие димерный гидрофобный контакт, полуконсервативный Phe31, ответственный за отсутствие внутренней полости в интерфейсе димера, и Lys35 и Asn92, которые участвуют в формировании уникальных водородных связей между мономерами. Эти факторы отличаются от описанных ранее для других белков HU из термофильных бактерий B.stearothermophilus и T.maritima.

Для подтверждений проведенного анализа были проведены направленные мутации АА остатков.

У полученных мутантов была исследована термостабильность методом ДСК (Таблица 1).

Таблица1: Влияние мутаций на температуры плавления HUSpm измеренных с помощью ДСК в условиях эксперимента: 2,0 мг / мл белка и 0,2 М NaCl.

Мутация

wt

F14A

F29A

V17T

F31L

L35T

N92K

Tmelt*, ˚C

74.5, 87.3

63.0

45.2, 59.2

74.2

64.2

49.7, 77.1

70.7

*В случае двух пиков на кривой ДСК, указаны две температуры.

Для отдельных мутантов также был проведен анализ их изменения электрофоретической подвижности.

Рисунок 1: EMSA, 12% ПААГ, 0.5хТБ буфер.

Из рисунка видно, что наибольшое влияние на электрофоретическую подвижность оказала замена полуконсервативного 31 фенилаланина.

Выводы:

  1. Основываясь на сравнительном анализе пространственной структуры HUSpm и других HU-белков, имеющих  различную термостабильность, были выявлены аминокислотных остатков остатки, потенциально ответственные за высокую термостабильность HUSpm.
  2. Были получены мутанты HU белка из Sp. Melliferum, позволившие проверить вклад в аномально-высокую термостабильность белка неконсервативных и полуконсервативных гидрофобных аминокислотных остатков.
  3. Было установлено, что из всех проверенных аминокислотных остатков остатков максимальное влияние на термостабильность имел неконсервативный F29, тогда-как полуконсервативный F31, закрывающий 100 А полость в области димерного контакта, характерную для ряда HU белков, влиял на способность белка изгибать ДНК. 
Используемые источники
1. Christodoulou, E., Rypniewski, W. R. & Vorgias, C. E. (2003) High-resolution X-ray structure of the DNA-binding protein HU from the hyper-thermophilic Thermotoga maritima and the determinants of its thermostability, Extremophiles. 7, 111-122.
2. Kawamura, S., Abe, Y., Ueda, T., Masumoto, K., Imoto, T., Yamasaki, N. & Kimura, M. (1998) Investigation of the structural basis for thermostability of DNA-binding protein HU from Bacillus stearothermophilus, The Journal of biological chemistry. 273, 19982-7.
3. Dillon, S.C. and C.J. Dorman, Bacterial nucleoid-associated proteins, nucleoid structure and gene expression. Nat Rev Microbiol, 2010. 8(3): p. 185-95.
Information about the project
Surname Name
Agapova Yulia
Project title
Structure-functional analysis of of bacterial HU-proteins.
Summary of the project
HU proteins are the most abundant DNA-binding proteins in prokaryotic organisms, playing an essential role in processes of DNA replication, repair, and recombination. Detailed analysis revealed that the spatial structure of the HUSpm dimer is similar to that of its bacterial homologs. At the same time according to DSC data, HUSpm has a high thermal denaturation temperature comparable (76С). In order to find the structural basis of HUSpm thermal stability, we identified amino acid residues potentially responsible for this feature and changed them by site-directed mutagenesis.
Keywords
HU proteins, DNA binding, thermal stability, hydrophobic core, Spiroplasma melliferum