Регистрация / Вход
Прислать материал

Влияние пектина AU701 на адгезивность Yersinia pseudotuberculosis к макрофагам J774, оцененное методом оптической ловушки.

Сведения об участнике
ФИО
Белозёров Владислав Сергеевич
Вуз
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Вятский государственный университет"
Тезисы (информация о проекте)
Область наук
Науки о жизни и медицина
Раздел области наук
Физико-химическая молекулярная и клеточная биология
Тема
Влияние пектина AU701 на адгезивность Yersinia pseudotuberculosis к макрофагам J774, оцененное методом оптической ловушки.
Резюме
Методом оптической ловушки оценивалось влияние пектина AU701 на адгезивность клеток Yersinia pseudotuberculosis к мышиным макрофагам на модельной системе "функционализированная липополисахаридом микросфера - эукариоцит". Показано достоверное (p < 0,01) увеличение адгезивности функционализированных микросфер к макрофагам линии J774 при добавлении в рабочую среду пектина AU701 в концентрации 500 мкг/мл.
Ключевые слова
Yersinia pseudotuberculosis, макрофаг J774, адгезивность, сенсибилизация микросфер липополисахаридом, метод оптической ловушки.
Цели и задачи
Цель
Оценить влияние пектина AU701 на адгезивность Yersinia pseudotuberculosis к мышиным макрофагам линии J774 методом оптической ловушки.

Задачи:
1) отработать метод сенсибилизации полистироловых микросфер препаратом липополисахарида Y. pseudotuberculosis;
2) оценить влияние пектина AU701 на силу взаимодействия сенсибилизированных микросфер и макрофагов J774 с использованием нанопинцета.
Введение

         Адгезия микроорганизмов является важным фактором реализации патогенетического потенциала возбудителей инфекционных заболеваний. Одним из важнейших факторов адгезии грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), покрывающий по разным данным до 75% площади поверхности микробных клеток [1]. Данный факт предполагает положительное или отрицательное участие этого компонента в первичном контакте прокариоцитов с эукариотическими клетками.

         Целью работы являлась оценка влияния пектина AU701 на силу отрыва сенсибилизированных микросфер от эукариоцитов с использованием метода оптической ловушки. 

Методы и материалы

         Полистироловые микросферы диаметром 1 мкм сенсибилизировали препаратом липополисахарида, выделенного из клеток Y. pseudotuberculosis, выращенных при +10 °С, методом водно-фенольной экстракции [2].

         Макрофаги J774 (Коллекция Института цитологии РАН, г. С.-Петербург) асептически пересевали на чашку "Fluorodish" диаметром 35 мм (WPI, США) с полной питательной средой RPMI-1640 до конечной концентрации (10-30)×103 клеток/мл, инкубировали в CO2-инкубаторе (5% СО2) при 37 °С в течение 18 ч. Измерения сил отрыва сенсибилизированных микросфер от поверхности макрофагов выполнены с помощью прибора Nano TrackerTM JPK Instruments AG (Германия) в фосфатном буферном растворе (ФБР) с добавлением пектина AU701 до конечной концентрации 100 и 500 мкг/мл. В качестве контроля использовали ФБР без добавления пектина. 

         Вслед за калибровкой прибора выбирали удобную для измерений клетку и осуществляли процедуру подведения клетки к микросфере, находящейся в лазерной ловушке, с расстояния около 4 мкм пьезостоликом с шагом 50 нм до их соприкосновения. Момент контакта фиксировали по трём скачкообразным изменениям сигнала квадрантного фотодетектора (КФД) и после паузы в 1 с осуществляли автоматическое отведение столика в обратном направлении с постоянной скоростью 100 нм/с. Амплитуду изменения сигнала пересчитывали в силу на основании проведённых калибровок чувствительности КФД и жёсткости ловушки (0,25-0,28 пН/нм). Статистический анализ результатов производили в программе Minitab 17.

Описание и обсуждение результатов

       Сравнение значений средних сил отрыва микросфер от поверхности макрофагов (см. таблицу) показало наличие статистически значимых отличий по сравнению с контролем (p< 0,01) в случае присутствия в среде пектина AU701 в концентрации 500 мкг/мл.

         Анализ кривых интегрального распределения сил отрыва (см. рисунок) для каждой из трёх сравниваемых групп подтверждает приведённые выше результаты.

         Таблица – Средние значения дистанций и сил отрывов

Концентрация пектина, мкг/мл

Дистанция отрыва,

нм

Сила отрыва, пН

Число опытов

100

740,4 ± 412,8

12,49 ± 4,55

38

500

876,9 ± 495,6

13,94 ± 5,55*

92

0 (контроль, ФБР)

863,0 ± 534,8

11,17 ± 4,93

94

Примечание: *– различия с контролем достоверны для p < 0,01.

Рис. 1 – Интегральное распределение сил отрыва микросфер от макрофагов J774 в зависимости от концентрации пектина: 1 – 0 мкг/мл (контроль), 2 – 100 мкг/мл, 3 - 500 мкг/мл. Аппроксимация к gamma-распределению.

         В работе [3] указывается на снижение адгезивных функций ряда грамотрицательных бактериальных патогенов (Escherichia coli, Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium) к клеткам линии НТ-29 под действием пектиновых олигосахаридов и хитоолигосахаридов.  При этом отмечено усиление антиадгезивного эффекта с увеличением концентрации исследуемых веществ. Аналогичные результаты по снижению  адгезии грамположительных условно-патогенных бактерий (Propionibacterium acnes, Staphylococcus aureus) были получены для пектина  PG-F2 женьшеня (диапазон эффективных концентраций – 0,25 – 0,50 мг/мл) [4].

         Использованный нами коммерческий препарат пектина AU701 обладает низкой степенью этерификации (36%) по сравнению, например, с высокоэтерифицированным пектином AU201 (72%). В связи с этим, увеличение средней силы отрыва модельных микросфер может объясняться изменением физико-химических свойств (заряда) поверхности эукариоцитов за счёт их обработки пектином.

                                               Выводы   

         1) Отработан метод сенсибилизации полистироловых микросфер препаратом липополисахарида Y. pseudotuberculosis.

         2) С использованием метода оптической ловушки установлено увеличение (p < 0.01) силы отрыва от макрофагов J774 сенсибилизированных микросфер в присутствии пектина AU701 в концентрации 500 мкг/мл, что, по-видимому, связано с увеличением общего отрицательного заряда поверхности макрофагов.

Используемые источники
1. Lu Q., Wang J., Faghihnejad A., Zeng H. and Liu Y. Understanding the molecular interactions of lipopolysaccharides during E. coli initial adhesion with a surface forces apparatus. Soft Matter, 2011, 20, 1–15.
2. Westphal O., Jann K. // Methods Carbohydr. Chem., 1965, 5, 83–91.
3. Wang Shanshan, Wang Jing, Mou Haijin, Luo Bing, and Jiang Xiaolu. Inhibition of Adhesion of Intestinal Pathogens (Escherichia coli, Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni, and Salmonella Typhimurium) by Common Oligosaccharides // Foodborne Pathog Dis. 2015, 12, 4, 360-365.
4. Lee J.H., Shim J.S., Lee J.S., Kim M.K., Chung M.S., Kim K.H. Pectin-like acidic polysaccharide from Panax ginseng with selective antiadhesive activity against pathogenic bacteria // Carbohydr Res. 2006, 3, 341, 9, 1154-1163.
Information about the project
Surname Name
Belozerov Vladislav
Project title
The effect of pectin AU701 on adhesiveness Yersinia pseudotuberculosis cells to J774 macrophage cells, estimated with use of the optical trap method.
Summary of the project
The effect of pectin AU701 on adhesiveness Yersinia pseudotuberculosis cells to mouse macrophages was estimated with use of the optical trap method in the model system "microsphere functionalized with lipopolysaccharide - eukaryotic cell". It was shown a significant (p < 0,01) increase in the adhesiveness of functionalized microspheres to J774 macrophage cells, when pectin AU701 at concentration 500 μg/ml was added to the fluid.
Keywords
Yersinia pseudotuberculosis, J774 macrophage, adhesiveness, microsphere sensitized with lipopolysaccharide, optical trap method.