Скрининг однонитевых разрывов днк лимфоцитов при действии различных факторов

Работа посвящена изучению влияния повреждающих факторов и различных условий инкубирования на однонитевые разрывы ДНК. В роли повреждающих факторов выступали СВЧ- и гамма- излучения, инкубирование проводилось в растворах наночастиц серебра и воды с пониженным содержанием дейтерия. В ходе выполнения работы были оценены степени повреждения лимфоцитов внешними факторами и найдены зависимости величинв повреждения от частоты/времени. Было показано, что наночастицы серебра оказывают разрушающее действие на ДНК лимфоцитов. Было выяснено, что вода с пониженным содержанием дейтерия оказывает благотворное влияние на лимфоцитов, активируя процессы реперации ДНК, либо ингибируя апоптоз

Целью данной работы является определение содержания ОР ДНК в иммунокомпетентных клетках, выделенных из цельной крови, при различных условиях их инкубирования и действия повреждающих факторов.
Задачами данной работы являются:
1. Изучение влияния ионизирующих излучений по количеству однонитевых разрывов ДНК лимфоцитов с использованием низкомолекулярного интеркалятора для скрининга ДНК-повреждений.
2. Выявление факторов, репарирующих ДНК-повреждения лимфоцитов, при инкубировании их в средах, содержащих пониженное содержание дейтерия.
3. Изучение действия наночастиц серебра на состояние ДНК лимфоцитов.

 

         Однонитевые разрывы (ОР) в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) являются самым многочисленным типом повреждения ДНК, который может возникать в лимфоцитах, при патологических процессах,ионизирующем излучении, нарушении функционирования ферментов клеточного ядра.

Работа направлена на решение фундаментальной научной проблемы – теоретическое и экспериментальное изучение воздействия повреждающих факторов на клетки крови для скрининга ДНК-повреждающих факторов. 

 

 

Лимфоциты, изолированные из крови, облучались СВЧ-излучением в течение 10 минут на частотах 50 ГГц, 70 ГГц при мощности 3мВт. Образцы облучались с помощью установки «Измеритель КСВН и ослаблений панорамный Р2-68 и Р2-69».

Другие пробы лимфоцитов были подвержены гамма-излучению препарата ¹³⁷Cs, активностью 0,104 МБк в течение 30, 60 и 90 минут.

Лимфоциты, изолированные из крови и троекратно отмытые, инкубировались в физиологическом растворе с добавлением НЧ серебра с диапазоном концентраций 0,621-1,863 мкг/л в течение 30 минут. Для эксперимента использовался головной раствор НЧ серебра с концентрацией 12,42 мкг/л 

Другие пробы лимфоцитов инкубировались в течение 16 часов при комнатной температуре в физиологическом растворе, приготовленном на воде с пониженным содержанием дейтерия (40 ± 2 ppm) – т.н. «легкая вода» и обычной воде (150 ± 2ppm). Для выяснения влияния «легкой» воды на жизнеспособность клеток in vitro. Для выяснения влияния времени инкубирования на жизнеспособность лимфоцитов, последние вымачивались в физрастворе, приготовленном на легкой воде в течение 16 часов.

Для инкубирования параллельные пробы лимфоцитов, выделенных из крови опытных и контрольных групп крыс, замачивали в 1 мл физиологического раствора, приготовленном на «легкой» воде, а другие аналогичные пробы замачивали в физиологическом растворе на обычной воде.

 

После лизирования клеток и соответствующей обработки растворов получены следующие данные: для лимфоцитов контрольной группы лабораторных животных, инкубированных в физиологическом растворе, приготовленном на обычной воде, содержание ОР ДНК на 22,96% больше, чем в растворе, приготовленном на «легкой» воде (отношение интенсивностей флюоресценции составляет 77,04 %); для лимфоцитов контрольной группы, инкубированных в физиологическом растворе, приготовленном на обычной воде, на 52,01% больше ОР, чем в растворе на «легкой» воде (отношение интенсивностей флюоресценции составляет 47,99%).

В лимфоцитах при воздействии СВЧ-излучения в течение 10 минут с частотой 50 ГГц на 40,02%, с частотой 70 ГГц на 49,77% больше ОР ДНК, чем в контрольном образце.

 В лимфоцитах при воздействии гамма-излучения ¹³⁷Cs с активностью 0,104 МБк в течение 30 минут на 44,34%, 60 минут на 56,54%, 90 минут на 68,26% больше ОР ДНК, чем в контрольном образце.

 В ходе проведенных экспериментов создавались концентрации НЧ серебра: 1,863 мкг/л, 1,242 мкг/л, 0,621 мкг/л. Результаты экспериментов показали, что в  представленных концентрациях соответственно на 28,82%, 26,8%, 27,43% больше ОР ДНК, чем в контрольном образце.

 В ходе выполнения эксперимента было показано, что вода с измененным изотопным составом защищает ДНК лимфоцитов от разрушения, либо активирует процессы репарации. Адаптация клеток к пониженным концентрациям дейтерия в среде может способствовать увеличению функциональной активности систем клетки, связанных со значительными траффиками ионов водорода и последующей активацией системы ДНК-репарации, связанной с большими затратами энергии. Среда с пониженным содержанием дейтерия создает более благоприятные условия функционирования клеток иммунной системы, о чем свидетельствует большая сохранность лимфоцитов при инкубации в подобной среде. 

Показано, что СВЧ-излучение деструктивно воздействует на молекулы ДНК лимфоцитов. Поскольку эффект возрастает с увеличением частоты, можно предположить, что использование в КВЧ-терапии, по возможности, более низких частот, будет увеличивать сохранность иммунокомпетентных клеток крови.

  Также при проведении исследований было выявлено разрушающее действие гамма-излучения на лимфоциты. Было показано, что деструктивное действие увеличивается со временем экспозиции, поэтому использование его в медицинских целях должно быть максимально локальным, а время воздействия лучевой терапии не превышать необходимого минимума, чтобы не повреждать здоровые ткани, лежащие за опухолью, и кровь.

Измерения ОР ДНК после инкубирования лимфоцитов в растворе, содержащем НЧ серебра, показали, что в изученном диапазоне концентраций (1.863-0,621 мкг/л) НЧ серебра разрушают молекулу ДНК. Оценка количества ОР ДНК лимфоцитов может служить одним из факторов применимости НЧ серебра в быту, для лекарственных средств, в медицинских целях.

1 Yoshida K. Three asparagine synthetase genes of Bacillus subtilis / K. Yoshida // J. Bacteriol - 1999. - № 181. - P. 6081–6091.
2 Suit H., Phil D. The gray lecture 2001: Coming technical advanced in radiation oncology. Int. J. Radiation oncology. byol., phys. 2002; 53; 4; p. 798-809.
3 Anyang Li, Yongle Li, Hua Guo, The origin of rotational enhancement effect for the reaction of H2O + H2 (D2) // The Journal of Chemical Physics, 2014, V.140, P.11102.
4 Sondi I., Salopek-Sondi B. J. Colloid Interface Sci., 275, 177 (2004)
5 Крутяков Ю. А. Синтез и свойства наночастиц серебра: достижения и перспективы / Крутяков Ю. А.// Успехи химии. – 2008. – Т. 77. - № 3.
6 Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow / A. Boyum // Scandinavian Journal of Clinical & Laboratory Investigation. - 1968. - Vol. 21. - № 97. - P. 1-9.

The paper studies the influence of damaging factors and different incubation conditions on the single-strand DNA breaks. In the role of damaging factors were the microwave and gamma radiation, the incubation was carried out in solutions of silver nanoparticles, and water with a low content of deuterium. In carrying out the work was to assess the degree of damage of lymphocytes by external factors and found dependences of damage on the frequency / time. It was demonstrated that the silver nanoparticles have a devastating effect on lymphocyte DNA. It was found that water with reduced deuterium content has a positive effect on lymphocyte activating processes reparation DNA or inhibiting apoptosis.