Исследование активности каспазы-3 в опухолях животных с помощью генетически-кодируемого FRET-сенсора

Апоптоз - регулируемый процесс программируемой гибели клеток. Активация каспазы-3 в опухолях животных была изучена с помощью генетически-кодируемого FRET-сенсора mKate2-DEVD-iRFP. В ходе исследования разработана методика детекции FRET-сигнала сенсора активности каспазы-3 в опухоли животных методом поверхностного флуоресцентного биоимиджига in vivo. Установлены изменения в интенсивности и времени жизни флуоресценции mKate2 в опухолевых клетках при запуске апоптоза in vitro, выявлена гетерогенность опухолевой ткани по различиям во времени жизни флуоресценции mKate2. Таким образом, оценка активности каспазы-3 может быть использована как способ ранней детекции апоптоза.

Целью работы является оценка активности каспазы-3 в экспериментальной опухоли животных с помощью нового генетически-кодируемого FRET-сенсора mKate2-DEVD-iRFP.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать активность каспазы-3 с помощью FRET-сенсора mKate2-DEVD-iRFP в опухолевых клетках in vitro;
2. Разработать методику детекции FRET-сигнала сенсора активности каспазы-3 в экспериментальной опухоли животных методом флуоресцентного биоимиджига in vivo;
3. Изучить активность каспазы-3 в опухолях животных на основе метода флуоресцентной конфокальной микроскопии с временным разрешением.

Апоптоз - регулируемый процесс программируемой клеточной гибели. Каспаза-3 является одним из основных ферментов этого процесса[1]. Для визуализации апоптоза в живых клетках в динамике широко применяют FRET (Fȍrster Resonance Energy Transfer) сенсоры активности каспазы-3 [3]. Актуальным остается создание и применение сенсоров на основе красных и ближне-инфракрасных белков, что позволит увеличить глубину визуализации, снизить влияние собственной флуоресценции животных тканей и токсическое действие зондирующего излучения [2]. Оценка активности каспазы-3 с использованием FRET-сенсоров может найти применение в медицине как способ ранней детекции запуска апоптоза и являться одним из показателей эффективности применяемого лечения. 

В данном исследовании был применён FRET-сенсор на основе mKate2 (дальне-красный GFP-подобный флуоресцентный белок в качестве донора) и iRFP (инфракрасный флуоресцентный белок в качестве акцептора), соединенных пептидной последовательностью DEVD [4]. Были использованы следующие клеточные линии: CT26; CT26, экспрессирующая сенсор mKate2–DEVD–iRFP; CT26, экспрессирующая флуоресцентный белок mKate2. В качестве объекта исследования использовались самцы и самки мышей Balb/c массой 18-20 г. Для получения опухолевой модели животным осуществлялась подкожная инъекция в область бедра 500 тыс. и 1 млн. опухолевых клеток, растворённых в 100 мкл PBS. Открытие опухоли осуществлялось под наркозом (золетил-рометар, 60 мкл внутримышечно). Для оценки интенсивности флуоресценции в опухолях животных in vivo применяли метод поверхностного флуоресцентного имиджинга (IVIS­ Spectrum, Caliper Life Sciences, США). Анализ сигнала флуоресценции проводили в программе LivingImage. Конфокальная флуоресцентная микроскопия с временным разрешением проводилась на лазерном сканирующем микроскопеLSM 710 (Carl Zeiss, Германия) с FLIM системой (Becker&Hickl, Германия). Анализ времени жизни флуоресценции проводили в программе SPCImage.

Методом конфокальной флуоресцентной микроскопии с временным разрешением (FLIM) in vitro было установлено, что время жизни флуоресценции донорного белка mKate2 в клетках CT26, экспрессирующих сенсор mKate2-DEVD-iRFP, ниже времени жизни флуоресценции свободного mKate2 (1,44±0,05 нс и2,02±0,07 нс соответственно), что обусловлено FRET-реакцией.

При индукции процесса апоптоза стауроспорином (5мкМ) in vitro выявлена активация каспазы-3, что сопровождается расщеплением последовательности DEVD, потерей FRET-реакции и увеличением интенсивности и времени жизни флуоресценции донорного белка mKate2.

Для оценки интенсивности флуоресценции в опухолях животных были подобраны настройки для метода поверхностного флуоресцентного имиджинга in vivo. У животных с опухолями СТ26 с сенсором mKate2–DEVD–iRFP было выявлено изменение интенсивности флуоресценции в разные дни роста опухоли. При этом показано отсутствие флуоресценции в опухоли СТ26 без сенсора (контрольная группа) при разных длинах волн возбуждения и эмиссии. Так же было проведено сравнение интенсивности флуоресценции FRET-сенсора (mKate2-DEVD-iRFP) в опухоли с закрытой кожей и с открытой кожей. Сравнение отношения интенсивности флуоресценции донорного белка mKate2 к флуоресценции FRET-пары в опухоли с закрытой кожей и в опухоли с открытой кожей показало их соответствие друг другу, что указывает на возможность регистрации флуоресцентного сигнала в опухоли закрытой кожей.

На следующем этапе изучали активность каспазы-3 в опухолях животных CT26, экспрессирующих сенсор mKate2-DEVD-iRFP или белок mKate2 с помощью метода конфокальной флуоресцентной микроскопии с временным разрешением ex vivo. Время жизни флуоресценции mKate2 в опухолях CT26, экспрессирующих белок mKate2, составило 2,28±0,05 нс, что соответствует времени жизни mKate2 в клеточной линии CT26 c белком mKate2 in vitro. При этом в опухолях CT26, экспрессирующих сенсор mKate2-DEVD-iRFP, были выявлены опухолевые клетки с разным временем жизни флуоресценции mKate2.

Таким образом, в результате проведенных исследований была изучена активация каспазы-3 с помощью генетически-кодируемого FRET-сенсора mKate2-DEVD-iRFP в опухолевых клетках in vitro, разработана методика детекции FRET-сигнала сенсора активности каспазы-3 в экспериментальной опухоли животных методом поверхностного флуоресцентного биоимиджига in vivo. Установлены различия в интенсивности и времени жизни флуоресценции mKate2 в опухолях животных, что указывает на гетерогенность опухолевой ткани. Полученные результаты указывают на возможность оценки процесса апоптоза в опухоли в динамике, что может быть использовано при оценке эффективности химиотерапии.

1. Borrás O., et al. Programmed cell death in plants and animals // Biotecnologíaplicada. 2006. Vol. 23. P. 1-10.
2. Petrovsky A., Schellenberger E., Josephson L., Weissleder R., Bogdanov A. Jr. Near-infrared fluorescent imaging of tumor apoptosis // Cancer Res. 2003. 63(8): 1936–1942.
3. Wu Y., Xing D., Luo S., Tang Y., Chen Q. Detection of caspase-3 activation in single cells by fluorescence resonance energy transfer during photodynamic therapy induced apoptosis // Cancer Lett. 2006. 235(2): 239–247
4. Zlobovskaya O. A., Sergeeva T. F., Shirmanova M. V. et al. Genetically encoded far-red fluorescent sensors for caspase-3 activity // BioTechniques. 2016. 60:62-68.

Apoptosis is a regulatory process of a programmed cell death. Activation of caspase-3 in animals’ tumors was studied by means of a genetically encoded FRET-based sensor mKate2-DEVD-iRFP. The method of registration of a FRET signal of a genetically encoded sensor of a caspase-3 activity in animals’ tumors in vivo was developed using fluorescence molecular imaging. Induction of apoptosis was accompanied with the changes of fluorescence intensity and lifetime of mKate2 in tumor cells in vitro. The difference in fluorescence lifetime of mKate2 revealed heterogeneity of tumor tissue. Thus, assessment of a caspase-3 activity can be used as a method of early apoptosis detection.