Получение интактного 5′-концевого фрагмента генома аттенуированного штамма вируса зеленой крапчатой мозаики огурца

В данной работе рассматриваются этапы получения интактного 5'-концевого фрагмента генома ВИРОГ-43М с мол. массой 348 нк. Эта работа является начальным этапом по получению полноразмерной копии кДНК вирусного генома, который можно использовать либо в качестве вакцины повышающей урожайность на фоне мозаики на 25-30 %, либо использовать ее в качестве вектора. С помощью такого вектора можно повысить защиту от сопутствующих патогенов, увеличить пищевую ценность, использовать в качестве клонотеки генов изучаемых растений и т.д. Все это способствует разработке новой вакцины или совершенствованию уже имеющейся, а также более широкому использованию аттенуированного штамма в качестве вектора.

Цель исследований
Получение интактного 5'-концевого фрагмента генома аттенуированного штамма вируса зеленой крапчатой мозаики огурца.
Задачи исследований
I. Выращивание (подготовка) растительного материала (растений огурца), вакцинация против ВЗКМО.
II. Проверка комплементарной ДНК (кДНК) на наличие всей полноразмерной вирусной последовательности.
III. Клонирование интактного 5'-концевого фрагмента кДНК аттенуированного штамма вируса зеленой крапчатой мозаики огурца.

Из покон веков огурец является неотъемлемой частью рациона человека. В России огуречный промысел очень хорошо развивается. В связи с возрастающим потреблением огурцов будут увеличиваться посевные площади тепличных хозяйств, но большие насаждения часто поражаются различными заболеваниями. Наиболее часто ущерб огурцам наносят вирусы, в частности ВЗКМО. Самым эффективным способом защиты растений огурца от ВЗКМО является вакцинация, которая производится аттенуированным штаммом ВЗКМО ВИРОГ-43М обладающим бессимптомностью, генетической стабильностью и способностью к интерференции с патогенными штаммами ВЗКМО. На фоне резкой мозаики можно ожидать прибавки урожая не менее 25-30 %. Также можно использовать вирусный геном в качестве вектора.

Объект исследований: аттенуированный штамм ВЗКМО ВИРОГ-43М, которым были заражены растения огурца гибрида Кураж F1.

Материалы

Специфические праймеры на ВЗКМО; специфические праймеры на pAL2-T вектор; pAL2-T вектор; компетентные клетки E.Coli штамма XL-blue.

Методы

Вакцинация растений; ПЦР-анализ, лигирование продукта ПЦР; химическая трансформация; выделение плазмидной ДНК. 

Для накопления ВИРОГ-43М использовали растения огурца гибрида Кураж. После достижения растений огурца стадии 1-2 настоящих листьев проводили их вакцинацию водной суспензией аттенуированного штамма ВЗКМО ВИРОГ-43М. Через 10 дней после вакцинации проводили отбор растительного материала для выделения тотальной РНК.

С выделенной РНК проводили синтез первой цепи кДНК. С полученной кДНК ставили ПЦР со специфическими праймерами на вирусную последовательность для получения 4 перекрывающихся фрагментов, составляющих весь вирусный геном. Как видно по результата электрофореза, в кДНК присутствует весь вирусный геном.

С кДНК ставили ПЦР в 3-ёх повторах с специфическими праймерами на вирусную последовательность 1dir(+) и 348(-). Как видно из полученных результатов, мы получили 5’-концевой фрагмент в высокой концентрации (ярко светящиеся полосы в треках 2-4).

В дальнейшем из геля выделяли ДНК-фрагмент (348 пар нуклеотидов), который затем встраивали в pAL2-T вектор. После лигирования проводили химическую трансформацию в клетки E.Coli штамма XL-blue. В результате культивирования выростали белые и голубые колонии. Белые колонии предположительно содержат рекомбинантную плазмиду со вставкой, а голубые колонии содержат сам рАL2-Т без вставки.

В ПЦР использовали плазмидную ДНК выделенную из белых колоний, и специфические праймеры на pAL2-T вектора M13dir и M13rev. Положительные сигналы, имели мол. массу, равную 568 пар нуклеотидов. Плазмиды без вставки с праймерами M13dir и M13rev давали сигнал на уровне мол. массы 220 пар нуклеотидов. Пробы 1, 5, 7 содержали вставку (специфическое свечение).

После подтверждения вставки, выделенные плазмиды 1, 5, 7 были секвенированы с прамером M13dir. По результатам секвенирования была получена нуклеотидная последовательность первых 348 нуклеотидов ВИРОГ-43М (идентичная последовательность в 1, 5, 7 пробе).

Результаты, полученные после секвенирования, были обработаны с помощью программы Blast, которая выявляет совпадения нуклеотидной последовательностью в базе данных. Результаты сравнения показали, что полученная нуклеотидная последовательность совпадает с последовательностью ВИРОГ-43 на 100 %.

Получение интакгного 5'-концевого фрагмента ВИРОГ-43М является начальным этапом по конструированию полноразмерной копии кДНК вирусного генома, которая необходима для его сохранения в неизменном виде.

Полноразмерный геном вируса можно также использовать в качестве вектора для:

* борьбы с сопутствующими возбудителями болезней огурца;

* повышения пищевой ценности;

* создания клонотек генов исследуемых растений;

* получения вакцин против различных возбудителей животных и человека.

Помимо этого, применение ВИРОГ-43М само по себе дает положительный эффект в виде повышения урожая на 25-30 % на фоне возникновения мозаики, что обусловлено интерференцией аттенуированным штаммом патогенного вируса.

1) Роль коротких РНК в устойчивости растений к биотическим и абиотическим стрессам / В.И. Малиновский и др. Вавиловский журнал генетики и селекции, –2013.
2) Славохотова, А.А. Изучение генетического полиморфизма аттенуированных и патогенных штаммов тобамовирусов, –2009.
3) Штамм вируса зеленой крапчатой мозаики огурца для вакцинации растений огурца: пат. 2320721 Российская Федерация МПК C12N 7/00 / Э.Н. Андреева и др.; заявитель и патентообладатель НИИ общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
4) Chengke Liu and Richard S. Nelson. The cell biology of Tobacco mosaic virus replication and movement // frontries in Plant Science, 2013.
5) Cucumber green mottle mosaic virus // description of plant viruses.
6) Karen-Beth G. Scholthof (Texas A&M University). Tobacco mosaic virus // The American Phytopathological society.

In this paper discusses the stages to get the intact 5'-end fragment of the genome VIROG-43M with a molecular weight of 348 nucleotides. This work is the initial stage for obtaining the full-size cDNA copies of the viral genome, which can be used either as a vaccine to increase the yield on mosaic background by 25-30 %, either use it as a vector. Using this vector it is possible to increase security against related pathogens, increase nutritional value, to use as clontech genes studied plants, etc. All this contributes to the development of new vaccines or improving existing, as well as greater use of the attenuated strain as a vector.