Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка эффективных продуцентов липаз и новых технологий их использования.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Выполнение этапа проекта
Проект
02.434.11.3006
Продолжительность работ
2005 - 2006, 17 мес.
Бюджетные средства
5,5 млн
Внебюджетные средства
0 млн

Разработать эффективные продуценты липаз, катализирующих реакции, приводящие к получению новых видов продукции, и позволяющих разработать новые технологии их использования в пищевой промышленности.

Этапы проекта

1
03.05.2005 - 31.08.2005
2
01.09.2005 - 09.12.2005
Задачей нашего исследования на данном этапе НИР является определение наиболее конструктивных подходов для получения высокопродуктивных продуцентов липаз, пригодных для широкого применения в пищевой промышленности, в том числе и для создания новых перспективных технологических процессов.
Проведение первого этапа патентных исследований позволило заключить, что в разработке необходимо использовать современные генно-инженерные методы, которые позволяют реализовывать различные подходы для повышения активности продуцентов, включая повышение уровня экспрессии генов липаз, увеличение числа копий генов липаз, обеспечение секреции в ферментационную среду. В ряде случаев можно успешно сочетать генно-инженерные и традиционные селекционные подходы.
В качестве реципиента культуры для получения липаз предлагается использовать дрожжи Yarrowia lipolytiсa, что позволит создать технологичный и высокоактивный продуцент (с оценочной активностью более 50 000 ед/л культуральной жидкости).
Для использования в разработке были также выбраны промоторы XPR2, POX2 и hp4d, консервативная мультикопийная последовательность Zeta, в качестве селективных маркеров предлагается использование генов генов URA3 и LEU2, позволяющих проводить отбор трансформантов при использовании в качестве реципиентных штаммов соответствующих ауксотрофных мутантов Yarrowia.
Таким образом, проведенные патентные исследования позволили выбрать направление исследования и способ решения поставленной задачи с учетом основных технических достижений и тенденций развития в данной области, что соответствует заданию на проведение патентных исследований.
Развернуть
3
01.01.2006 - 31.07.2006
Созданы необходимые рекомбинантные конструкции для экспрессии и секреции выбранных гетерологичных и гомологичных липаз, выбран реципиентный штамм, произведено клонирование выбранных липаз с целью оценки эффективности их экспрессии, созданы специальные рекомбинантных конструкции для повышения копийности клонируемых генов липаз. Проведено клонирование в Yarrowia lipolytica трех липазных генов и проведена оценка экспрессии гетерологичных генов липаз. Разработан метод прямой селекции штаммов с повышенной продуктивностью секретируемой липазы, получены мутанты с увеличением активности в 2-3 раза.
  Получены варианты рекомбинантных конструкций, способных к множественной интеграции с геном LIP 2 под несколькими эффективными промоторами, в т.ч. и под собственным промотором LIP2.
  Проведено изучение ферментационных процессов получения липаз в колбах и начаты работы по оптимизации ферментационных процессов в ферментере.
Развернуть
4
01.08.2006 - 31.10.2006
В ходе работы была освоена генно-инженерная методология, необходимая для создания суперпродуцентов на основе Yarrowia lipolytica.
Была разработана трансформация ДНК на микрочастицах вольфрама в клетки мицелиальных грибов Rhizopus oryzae с помощью гелиевой пушки и отбор трансформантов с использованием селективных маркеров lacZ. Впервые была продемонстрирована возможность использования гена lacZ в качестве селективного маркера с отбором на среде с лактозой при клонировании в клетки мицелиальных грибов. В целях стабилизации трансформантов выявлены и изучены несколько повторяющихся последовательностей генома Rhizopus oryzae, которые использовались для получения множественных интеграционных копий гена ROL.
При разработке системы клонирования в клетки дрожжей Yarrowia lipolytica были клонированы селективные маркеры URA3 и LEU2 , созданы модификации этих генов (с пониженной активностью продуктов), позволяющие отбирать транcформанты с увеличенной дозой гена, проверена эффективность экспрессии этих генов, клонированных в хромосоме реципиента под различными промоторами pPOX2 ( олеиновая кислота), pXPR2 ( пептон), pLIP2 и созданным на основе pXPR2 гибридным конститутивным промотором php4d ( стационарная фаза).
  Проведены исследования возможностей увеличения копийности клонированных генов с использованием повторяющихся в геноме Zetа последовательностей и специально сконструированного селективного маркера ura3d4, обеспечивающего комплементацию URA3 мутации при увеличенной дозе гена. Предложен новый подход для увеличения копийности интегрированных генов с использованием специальной конструкции ДНК с липазным геном, позволяющей многократно последовательно трансформировать клетки, повышая копийность липазного гена.
  Для оценки липазной активности клонов разработаны различные тесты. Показана эффективность использования липазы LIP2 для транэтерификации растительных масел со спиртами с целью получения эфиров жирных кислот. В результате выполненных работ с использованием как генно-инженерных, так и автоматизированных селекционных походов, создан штамм продуцент Yarowia lipolytica липазы, позволяющий получить в ферментере продукцию липазы более 50 000 ед /мл., что является сравнимым с лучшими мировыми аналогами и дает возможность разработки рентабельного промышленного производства липазы. Разработаны теоретические и экспериментальные подходы для дальнейшего значительного повышения активности штамма продуцента.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы

Программное мероприятие

1.2 Проблемно-ориентированные поисковые исследования фундаментального характера
Продолжительность работ
2011 - 2012, 20 мес.
Бюджетные средства
10 млн
профинансировано
Тема
Разработка эффективных продуцентов липаз и новых технологий их использования
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
5,5 млн
Количество заявок
3
Тема
Получение штаммов-продуцентов сульфидов металлов на основе метагеномного анализа шахтных вод
Продолжительность работ
2014 - 2016, 29 мес.
Бюджетные средства
42 млн
Количество заявок
4
Тема
Разработка способов получения высокоэффективных продуцентов белков для терапевтических, диагностических и производственных нужд.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 20 мес.
Бюджетные средства
60 млн
Количество заявок
16
Тема
Разработка биотехнологии получения рекомбинантных белков для пищевой промышленности
Продолжительность работ
2017 - 2019, 26 мес.
Бюджетные средства
46 млн
Количество заявок
0
Тема
Разработка технологии получения новых сапонинсодержащих растительных эмульгаторов для пищевой промышленности.
Продолжительность работ
2012 - 2013, 21 мес.
Бюджетные средства
147 млн
Количество заявок
2