Изучение механизмов действия ферментов защитно-репарационных систем

Проведен анализ научной литературы по изучению механизмов действия ферментов репарации человека. Наработано необходимое количество фермента и субстратов различной степени специфичности. Разработана общая методология проведения исследований.
1.1 Анализ научной литературы по изучению механизмов действия ферментов репарации.
1.2 Проведение патентных исследований по ГОСТ 15.011-96 методов определения активности ферментов, в том числе, ферментов репарации.
1.3 Обоснование принятого направления исследования по выяснению природы высокой специфичности ферментов репарации человека, основанного на анализе конформационной динамики ферментов и ДНК-субстратов.
1.4 Наработка необходимых количеств фермента и субстратов различной степени специфичности.
1.5 Разработка общей методики проведения исследований.
2.1 Изучение кинетических и термодинамических характеристик процесса с участием фермента репарации человека 8-оксогуанин ДНК-гликозилазы.
2.2 Обработка полученных результатов с помощью математических программ и компьютерного моделирования.
2.3 Построение кинетических моделей ферментативного процесса с участием 8-оксогуанин ДНК-гликозилазы, выяснение природы его специфичности.
2.4. Сопоставление результатов эксперимента с результатами расчетов и математического моделирования.
2.5 Изучение способности эффекторов вызывать ускорение ферментативной реакции.
2.6 Проведение патентных исследований по способам индукции защитно-репарационных систем человека.
3.1 Обобщение результатов предыдущих этапов работ. Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
3.2 Проведение дополнительных патентных исследований и подготовка патентов по способам индукции защитно-репарационных систем человека и по методу определения активности ферментов по регистрации флуоресценции в миллисекундном диапазоне.
3.3 Разработка рекомендаций по использованию результатов проведенных НИР.

Изучена динамика конформационных переходов в ферменте репарации 8-оксогуанин–ДНК-гликозилазе человека hOgg1 в ходе каталитического цикла. Для исследования применен метод остановленной струи с детекцией флуоресценции остатков триптофана белка. В качестве субстратов использованы 12-тизвенные ДНК-дуплексы, содержащие в одной из цепей остатки 8-оксогуанозина, дезоксирибозы или тетрагидрофурана. Показано, что фермент претерпевает многостадийные конформационные превращения в ходе ферментативного процесса. Для установления природы каждой стадии методом гель-электрофореза изучена кинетика накопления промежуточных и конечных продуктов превращения субстрата. Показано, что аналог природного гетероциклического основания 8-бромгуанин выступает в качестве индуктора ферментативной реакции. Предложены кинетические схемы взаимодействия фермента со всеми исследованными субстратами. Определены константы скорости элементарных стадий, входящих в кинетические схемы.

В ходе выполнения научно-исследовательской работы изучен кинетический механизм действия фермента защитно-репарационной системы человека 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы hOgg1, удаляющей окислительные повреждения в геномной ДНК, и способ её индукции; исследована динамика конформационных превращений фермента, установлена природа стадий, ответственных за высокую специфичность действия фермента. В качестве субстратов этого фермента использованы двуцепочечные ДНК, содержащие окисленное гетероциклическое основание, продукты его промежуточного превращения, их неприродные и нереакционноспособные аналоги и субстраты, содержащие некомплементарные нуклеотиды, которые расположены напротив окисленного гуанозина в комплементарной цепи ДНК. Исследование динамики конформационных превращений в молекулах ферментов репарации проведено на спектрометре остановленной струи «Эпплайд фотофизикс», позволяющем изучать поведение молекул в миллисекундном диапазоне времени с использованием малых объемов растворов.
С помощью спектрометра остановленной струи произведена регистрация изменений интенсивности флуоресценции фермента. Показано, что фермент претерпевает многостадийные конформационные превращения в ходе ферментативного процесса. Проведен кинетический анализ механизма узнавания ферментом субстрата и его превращения в конечный продукт. Предложены кинетические схемы взаимодействия фермента со всеми исследованными субстратами и определены константы скорости элементарных стадий, входящих в кинетические схемы. Выделены ключевые стадии реакции, ответственные за высокую селективность действия фермента репарации человека. Идентифицированы соединения, выступающие в качестве кофакторов ферментативной реакции.