Регистрация / Вход
Прислать материал

Создание биокатализатора на основе гидролазы из мутантного штамма E.coli для получения 7-АХЦК - полупродукта процесса синтеза цефаклора.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Выполнение этапа проекта
Проект
02.434.11.7089
Организация
ФГУП ГНЦА

Проведение поисковых исследований и получение новых знаний с использованием возможностей международной кооперации

Этапы проекта

1
08.11.2005 - 09.12.2005
Изучены кислотно-основные свойства указанных соединений и их растворимость. Определены значения рК и рI амфолитов, а также величины их характеристической растворимости. Рассчитаны рН-зависимости растворимости хлор-ЦЕФ G, 7-АХЦК и ФУК в широком интервале значений рН.
Изучено влияние хлор-ЦЕФ G на растворимость 7-АХЦК. Обнаружен эффект комплексообразования этих соединений, приводящий к увеличению растворимости аминокислоты. Определена константа нестойкости комплекса.
  На основании полученных в ходе исследования результатов, а также данных литературы проведен выбор концентрационного состава растворов, моделирующих реакционные массы процесса ферментативного гидролиза хлор-ЦЕФ G. Проведение сравнительных испытаний ферментов, продуцируемых мутантным штаммом – продуцентом гидролазы хлор-ЦЕФ G (ГНЦА, Россия) и штаммом E. coli – продуцентом пенициллин G амидазы (СИИА, Китай), а также биокатализаторов на их основе в процессе ферментативного получения 7 АХЦК. Выбор наилучшего источника целевого фермента и способа получения биокатализатора на его основе.Проведены эксперименты по выделению 7-АХЦК из модельных растворов, подтверждающие расчетные данные.
Развернуть
2
01.01.2006 - 31.03.2006
Проведен анализ патентной литературы по ферментативным методам получения 7-АХЦК за 1990-2005 г.г. и составлен отчет по патентным исследованиям. Разработан аналитический метод определения активности гидролазы хлор-ЦЕФ G по целевой ферментативной реакции с использованием метода ВЭЖХ для контроля содержания продукта (7-АХЦК) в реакционной смеси. Составлена аналитическая методика определения ферментативной активности гидролазы хлор-ЦЕФ G. Проведено изучение физико-химических свойств биокаталитической системы процесса трансформации хлор-Цеф G в 7 АХЦК, таких как характеристическая растворимость и кислотно-основные свойства (рК, рI) субстрата (хлор-ЦЕФ G) и продуктов (7 АХЦК и фенилуксусной кислоты). Обнаружен эффект взаимовлияния компонентов биокаталитической системы. Полученные результаты оформлены в виде отчета о НИР.
Разработанный аналитический метод контроля активности гидролазы хлор-ЦЕФ G необходим для проведения работ в рамках данного проекта по созданию мутантного штамма – продуцента гидролазы хлор-ЦЕФ G и биокатализатора не его основе, а также будет в дальнейшем использован при создании биокаталитического процесса трансформации хлор ЦЕФ G в 7 АХЦК и соответствующей технологии.
Данные о физико-химических свойствах субстрата и продуктов процесса ферментативного получения 7-АХЦК, с учетом их взаимовлияния, будут использованы в дальнейшем при разработке соответствующей биокаталитической технологии.
Развернуть
3
01.04.2006 - 15.09.2006
Разработан и оптимизирован метод получения биокатализатора на основе гидролазы хлор-ЦЕФ G, продуцируемой мутантным штаммом ИВАД 5, обеспечивающий выделение фермента из клеточной биомассы с выходом активности не менее 70 % и иммобилизацию выделенного фермента с выходом активности не менее 30 %. Выделение гидролазы хлор ЦЕФ G осуществляют методом так называемого «химического лизиса», а иммобилизацию – путем включения модифицированного фермента в полиакриламидный гель.
Разработана лабораторная методика получения биокатализатора на основе гидролазы хлор-ЦЕФ G, включающая стадии выращивания посевного материала, биосинтеза, выделения и иммобилизации фермента, а также аналитические методы постадийного контроля процесса.
Развернуть
4
16.09.2006 - 31.10.2006
На этапе 4 выполнена работа по сравнительному изучению ферментов, продуцируемых мутантным штаммом ИВАД 5 и штаммом E. coli (СИИА, Китай), а также биокатализаторов на их основе в процессе ферментативного получения 7 АХЦК. Разработан метод проведения ферментативного гидролиза хлор ЦЕФ G. Проведен выбор наилучшего источника целевого фермента и способа получения биокатализатора на его основе с учетом таких критериев, как продуктивность штамма по целевой ферментативной активности, эффективность процессов выделения и иммобилизации фермента, достигаемая степень целевого гидролиза субстрата, наличие побочных продуктов трансформации. Сравнение изученных штаммов показывает, что биокатализаторы на основе ферментов из обоих продуцентов пригодны для разработки ферментативной технологии получения 7-АХЦК, так как обеспечивают высокую степень трансформации субстрата хлор-ЦЕФ G в целевой продукт (92-95 %), не давая при этом побочных продуктов. Однако, применение созданного в ходе данной работы мутантного штамма ИВАД 5 в качестве источника гидролазы хлор-ЦЕФ G предпочтительнее с точки зрения продуктивности штамма (выше на 30 %) и эффективности процесса выделения фермента (выше на 15 %). В случае использования китайского штамма E. сoli, имеющегося в СИИА, потребуется дополнительная работа по оптимизации процессов биосинтеза и выделения фермента. Полученные результаты оформлены в виде Отчета о НИР (заключительный).
Результаты проведенных исследований представляют собой научную основу для разработки технологии ферментативного получения 7-АХЦК – первой стадии двухстадийной биокаталитической технологии получения антибиотика цефаклора. Планами дальнейшей международной кооперации между ГНЦА и СИИА предусмотрено создание технологии в целом. Ближайший этап сотрудничества предполагает совместную разработку нового биокатализатора для второй стадии процесса получения цефаклора, заключающейся в ферментативном ацилировании 7 АХЦК.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы

Программное мероприятие

1.2 Проблемно-ориентированные поисковые исследования фундаментального характера
Развитие перспективных биотехнологий для нефтегазового комплекса 1. Изучение состава жирных кислот термофильных микроорганизмов. 2. Разработка способов интенсификации процесса биохимической очистки сточных вод от сульфатов и тяжелых металлов. 3. Прогноз биологической активности и разработка методов направленного синтеза фурилзамещенных 1,3-диогетероциклоалканов и их ациклических производных для изыскания в их ряду потенциальных регуляторов роста растений и микроорганизмов. 4. Скрининг штаммов базидиальных грибов-продуцентов липидов – сырья для производства биодизельного топлива. 5. Отработка операции культивирования грибов – продуцентов липидов на различных питательных средах. 6. Исследование новых микроорганизмов, являющихся биокатализаторами реакции водяного газа. 7. Применение микробиологического метода в технологической схеме утилизации попутного нефтяного газа. 8. Оценка активности гидролаз термофильных микроорганизмов. 9. Проведение сравнительной оценки эффективности штаммов микроорганизмов – биокатал
Продолжительность работ
2011, 5 мес.
Бюджетные средства
2,3 млн
профинансировано
Тема
Мутантные оксидазы Д-аминокислот с улучшенными свойствами для создания биокатализаторов для биотрансформации и биосенсоров.
Продолжительность работ
2009, 8 мес.
Бюджетные средства
3 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка биокаталитических процессов как альтернативы органического синтеза
Продолжительность работ
2017 - 2019, 26 мес.
Бюджетные средства
46 млн
Количество заявок
0
Тема
Ферменты в реакциях тонкого органического синтеза
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Количество заявок
3
Тема
Проблемно-ориентированные поисковые исследования фундаментального характера по приоритетным направлениям развития науки и техники в рамках подписанных межправительственных соглашений Российской Федерации по научно-техническому сотрудничеству с зарубежными странами
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
87,79 млн
Количество заявок
217
Тема
Обеспечение процесса содержательной экспертизы электронных образовательных ресурсов
Продолжительность работ
2011 - 2012, 16 мес.
Бюджетные средства
20 млн
Количество заявок
1