Регистрация / Вход
Прислать материал

Ферменты в реакциях тонкого органического синтеза.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Выполнение этапа проекта
Проект
02.435.11.3005
Организация
НИИ ФХБ МГУ
Продолжительность работ
2005 - 2006, 18 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Внебюджетные средства
0 млн

Разработка процессов органического синтеза оптических активных полупродуктов в производстве лекарственных средств, мономеров, физиологически активных соединений с помощью различных ферментов (дегидрогеназ, оксидаз, гидролаз и т.д.), доведение этих процессов до промышленного уровня. Создание генно-инженерных штаммов – продуцентов рекомбинантных ферментов для хирального синтеза, улучшение свойств этих ферментов с помощью методов белковой инженерии, разработка крупмномасштабных процессов получения биокатализаторов на основе ферментов с заданными свойствами.

Соисполнители

Организация
ООО "БиоТИР"
Организация
ИНЭОС РАН

Этапы проекта

1
01.04.2005 - 15.09.2005
2
16.09.2005 - 09.12.2005
Проведено клонирование и секвенирование генов пенициллинамидазы, оксидазы Д-аминокислот и формиатдегидрогеназы, созданы экспрессионные векторы для культивирования ферментов, проведена проверка этих векторов на продуктивность, получены образцы рекомбинантных биокатализаторов.
Осуществлен анализ эффективности точечных мутаций в пенициллин амидазе, а также оксидазе Д-аминокислот T.variabilis с помощью методов молекулярного моделирования. По результатам молекулярного моделирования специфичности пенициллинацилазы из E.coli был намечен ряд остатков активного центра, варьирование которых должно повысить эффективность фермента в целом наборе биокаталитических процессов, представляющих прикладной интерес.
На основе структуры оксидазы Д-аминокислот из R.gracilis была построена компьютерная модель мономера оксидазы Д-аминокислот из T.variabilis. На основании анализа данной модели найдены остатки аминокислот, являющиеся наиболее перспективными центрами для мутагенеза.
В процессе работы, получены препараты рекомбинантных пенициллинацилазы, формиатдегидрогеназы и оксидазы Д-аминокислот. Для получения препаратов ферментов, были изучены и оптимизированы условия экспрессии (такие как температура, тип индуктора и время индукции, условия аэрации, рН среды и т.д.), выделения и очистки получаемых ферментных препаратов. На следующих этапах исследования, полученные ферментные препараты будут количественно охарактеризованы и использованы для проведения энантиоселективных биокаталитических превращений.
Развернуть
3
01.01.2006 - 30.06.2006
В результате выполнения третьего этапа НИР, разработаны методики получения гомогенных препаратов ферментов и количественной характеристики их каталитической активности и специфичности по отношению к широкому ряду субстратов. Проведено количественное изучение термо- и рН- стабильности полученных ферментных препаратов, зависимости кинетических свойств ферментов от концентрации кофакторов и субстратов биокаталитического превращения. В результате, определены кинетические параметры ФДГ из C.boidinii. Показано, что при концентрациях формиата натрия выше 0,5 М величина KM фермента по NAD+ остается постоянной. Исследована кинетика инактивации ФДГ, показано, что процесс термоинактивации ФДГ имеет мономолекулярный характер и описывается теорией активированного комплекса. Изучено влияние концентрации фосфата и формиата натрия на термостабильность ФДГ. Установлено, что в присутствии высоких концентраций солей происходит значительная стабилизация фермента. Изучена рН- и термостабильность оксидазы D-аминокислот. Определен оптимум рН-стабильности, предложена общая схема термоинактивации DAAO из дрожжей T.variabilis. Разработаны методики определения энантиомеров первичных аминосоединений методом жидкостной хроматографии, основанного на разделении стереоизомерных изоиндолов, образующихся в результате дериватизации первичных аминогрупп соединений, и подана патентная заявка на данное изобретение.
Развернуть
4
01.07.2006 - 31.10.2006
Получены препараты рекомбинантных пенициллинацилазы, формиатдегидрогеназы и оксидазы Д-аминокислот – ферментов, имеющих важное значение в реакциях тонкого органического синтеза, в том числе для получения оптически активных соединений и лекарственных препаратов. Разработаны методики получения гомогенных и иммобилизованных препаратов ферментов и количественной характеристики их каталитической активности и специфичности по отношению к широкому ряду субстратов. Разработаны биокаталитические процессы получения ряда оптически активных соединений с использованием полученных препаратов ферментов. В частности;
1. Разработана высокоэффективная методика крупномасштабного выделения рекомбинантной формиатдегидрогеназы из клеток E.coli в двухфазных системах на основе соль-полиэтиленгликоль-вода. Данный метод позволяет получить препараты формиатдегидрогеназы до 80% степени чистоты с выходом до 89%. Процесс легко масштабируется и не требует сложного оборудования
2. Формиатдегидрогеназа была успешно использована для синтеза оптически активного изотопно меченого [4R-2H]NADH. Целевой продукт был получен с 98% выходом и значениями оптической чистоты и степенью мечения не менее 99%.
3. Разработан метод получения поперечно сшитых агрегатов ПА, отличающийся высокой эффективностью и простотой. Этот метод позволяет получать препараты иммобилизованной ПА, характеризующиеся высокой каталитической активностью и повышенной операционной и рН-стабильностью.
4. Разработан биокаталитический процесс препаративного получения функционализированных сульфгидрильных соединений. Показана возможность применения полученных полифункционализированных тиолов в качестве SH-реагента для определения энантиомеров аминосоединений методом ВЭЖХ.
5. Проведен биокаталитический процесс получения терт-L-лейцина из рацемической смеми с помощью рекомбинантной оксидазы Д-аминокислот. Выход целевого продукта и оптическая чистота составляют не менее 99%.
Опубликовано 13 научных статей по тематике государственного контракта, , сделано 25 докладов и сообщений на научных конференциях и симпозиумах по теме исследований.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы

Программное мероприятие

1.3 Прикладные разработки в рамках системы приоритетных направлений
Продолжительность работ
2008 - 2011, 39 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Организация
НИИ ФХБ МГУ
профинансировано
Тема
Ферменты в реакциях тонкого органического синтеза
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Количество заявок
3
Тема
Создание новых ферментов для модификации и синтеза антибиотиков методами белковой инженерии.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 14 мес.
Бюджетные средства
32 млн
Количество заявок
6
Тема
Разработка биокаталитических процессов как альтернативы органического синтеза
Продолжительность работ
2017 - 2019, 26 мес.
Бюджетные средства
46 млн
Количество заявок
0
Тема
Рациональный дизайн промышленных ферментов, основанный на методах молекулярного моделирования
Продолжительность работ
2008 - 2011, 39 мес.
Бюджетные средства
72 млн
Количество заявок
2
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства на основе рекомбинантного бифункционального фермента медицинской пиявки, обладающего тромболитическим действием
Продолжительность работ
2013 - 2015, 25 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2