Генно-инженерные технологии получения рекомбинантных полипептидов для медицинского применения.

Клонированы гены тимозина-1, глюкагона, кальцитонина лосося в экспрессионных векторах. Плазмидные карты и паспорта штаммов-продуцентов E.coli BL21(DE3)/pERThy1 гибридного белка, содержащего интеин Sce Vma и тимозин 1 человека, E.coli ER2566/ pER-Gl гибридного белка, содержащего мини-интеин dnaB из Synechocystis sp. и глюкагона, способные к автокаталитическому расщеплению с образованием целевых белков прилагаются к отчету.
Осуществлен выбор штаммов-носителей и проведены исследования по оптимизации условий ферментации штаммов-продуцентов и выделения гибридных белков тимозина человека — интеин, глюкагон - интеин.
Изучена экспрессия штамма в E.coli и оптимизированы условий автокаталитического расщепления гибридного белка, содержащего интеин и тимозин-1 человека с целю получения целевого продукта. Методика получения гибридного белка , содержащего интеин и тимозин-1 человека представлена в отчете.
Разработан и оптимизирован биотехнологический способ получения субстанции рекомбинантного глюкагона, созданы методика и лабораторный регламент его получения. Технологические разделы лабораторного регламента представлены в настоящем отчете. В соответствии с разработанным регламентом наработана и сертифицирована опытная партия субстанции рекомбинантного глюкагона.
Проведены патентные исследования по возможности патентования штаммов-продуцентов для получения рекомбинантных полипептидов тимозина и глюкагона.

Проведены экспериментальные работы по оптимизации процесса ферментации и массштабированию процесса биотехнологического получения субстанции рекомбинантного. На основании полученных результатов создан лабораторный регламент получения субстанции рекомбинантного тимозина -а! из биомассы продуцента Е.соН, наработаны и сертифицированы опытные партии препарата для обеспечения работ по регламентированным доклиническим исследованиям препарата. Проведен патентный поиск по отечественным и зарубежным базам данных, оформлена и подана заявка на патент РФ на способ получения рекомбинантного тимозина -ос1.

В результате выполнения работ по этапу получены следующие основные результаты:
1.Завершены работы по созданию биотехнологического способа получения фармацевтической субстанции препарата Глюкагон.. Наработаны опытные партии препарата и изучены их физико-химические характеристики в сравнении с аналитическим стандартом Европейской фармакопеи (Human glucagon EPY 0000191). Продемонстрирована идентичность свойств сравниваемых образцов. Полученные результаты оформлены в аналитический паспорт качества партии препарата и фармакопейную статью предприятия.(ФСП), составленную в соответствии с ОСТ 91500.05.001-00. Опытная партия препарата была передана в лабораторию биологических испытаний ФИБХ РАН (г.Пущино, московской обл. ) для проведения регламентированных доклинических испытаний.
2.В рамках программы доклинических испытаний проведено экспериментальное изучение препарата Глюкагон на модели сахарного диабета (крысы СD) в соответствии с разработанными ранее протоколами исследования по международным стандартом GLP и согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №267 от 19.06.2003. Показано, что эффективность препарата генно-инженерного глюкагона, полученного по разработанной авторами проекта технологии, сопоставима с эффективностью аналитического стандарта глюкагона человека Европейской фармакопеи.
3. Созданы генно-инженерные конструкции гибридного белка, содержащего кальцитонин лосося и интеин и способного к автокаталитическому расщеплению с образованием целевого белка. Разработан оптимальный метод получения субстанции генно-инженерного кальцитонина. Паспорт штамма-продуцента кальцитонина и методика получения субстанции препарата представлены в отчете.
  В результате реализации проекта в период 2005-2006 гг. коллективом исполнителей проведены экспериментальные работы по созданию принципиально новых генно-инженерные конструкций для получения гибридных белков, в состав которых входят тимозина- 1, кальцитонина, глюкагона и соответствующие интеины, разработаны методы получения целевых фармацевтических субстанций, изучены их физико-химические и биологичесике свойства и созданы комплекты научно-технической и технологической документации с целью осуществления регистрационных процедур в соответствии с регламентом, предусмотренным в организациях Минздравсоцразвития Р