Регистрация / Вход
Прислать материал

Метод восстановления эпителиально-мезенхимальных дефектов с помощью стволовых клеток.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Выполнение этапа проекта
Проект
02.435.11.3020
Организация
ИНЦ РАН
Продолжительность работ
2005 - 2006, 13 мес.
Бюджетные средства
7,5 млн
Внебюджетные средства
0 млн

создание тканевого эквивалента, обогащенного стволовыми клетками и представляющего собой трехмерную композицию, включающую клетки стромы, эпителия и внеклеточный матрикс, для восстановления целостности тканевых дефектов, в том числе ожогов кожи и роговицы.

Этапы проекта

1
19.09.2005 - 31.10.2005
Разработан эквивалент полной кожи, который состоит из двух основных типов клеток кожи (кератиноциты и фибробласты) и коллагена I типа, полимеризующегося в физиологических условиях. Коллагеновый гель с заключенными в нем аллогенными фибробластами представляет собой трехмерную структуру и является аналогом дермы кожной ткани. Дермальный эквивалент служит субстратом для формирования на его поверхности культивируемыми кератиноцитами аналога эпидермиса. Такая композиция взаимодействующих клеток составляет аналог полной кожи. После трансплантации этого клеточного продукта на рану фибробласты участвуют в формировании сначала грануляционной ткани, а затем дермы восстанавливаемой кожной ткани, а растущие кератиноциты образуют эпидермис. Используемые кератиноциты могут быть как аллогенными, так и аутологичными. В ходе выполнения работы установлены для данных условий формирования аналога полной кожи наиболее оптимальные соотношения количеств фибробластов и кератиноцитов как 1:10.
Разработан метод выделения стромальных клеток из костного мозга кролика, которые способны к пролиферации и остеобластической дифференцировке in vitro. Для выделения использован метод трехкратной ферментативной обработки биопсийного материала при 37°С смесью
»трипсин (0,25%, Difco) – версена (0,02%, Биолот)» в соотношении 1: 4. Клетки костного мозга суспендируются в ростовой среде и высеваются в чашки Петри из расчета 1-3х105 ядросодержащих клеток/см2. Ростовая среда представлена смесью питательных сред DMEM и F12 (80%), сыворотки эмбрионов коров – СЭК (10-20%), гентамицина (50мкг/мл). Через 2 суток в ростовую среду добавляется 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты, необходимой для нормальной дифференцировки остеогенных клеток. Для стимуляции дифференцировки остеобластов в ростовую среду добавляется дексаметазон (10-8 моль) и b-глицерофосфат Na (10-5 моль).
Пролиферативная активность остеогенных клеток контролируется по индексу пролиферации и по формированию ими клеточного пласта или монослоя. Жизнеспособность клеток контролируется с помощью окраски их 0,04% раствором трипанового синего. Установлено, что первичные стромальные клетки костного мозга кролика формируют клеточный пласт через 10-12 суток культивирования. Индекс пролиферации клеток второго пассажа составлял 2-3. С помощью гистологического метода окраски смесью BCIP-NBT (Sigma) показано присутствие в культуре клеток, продуцирующих щелочную фосфатазу, которая является маркером стволовых и остеогенных клеток костного мозга. Активность щелочной фосфатазы измерялась по модифицированному методу Лоури (Rickard et al, 1994) и увеличивалась на более поздних пассажах. Накопление минерала (кальция) определялось по методу Коса и наиболее отчетливо выявлено на 3-м пассаже культивирования.
Разработаны Технические условия приготовления эквивалента полной кожи «Полный эквивалент кожи, ПЭК». Они включают в себя описание продукта и метод приготовления его; технические требования к продукту; требования к материалам, используемым для его приготовления; методы контроля; условия хранения и транспортировки; указания по эксплуатации.
Развернуть
2
01.11.2005 - 08.12.2005
3
01.01.2006 - 31.03.2006
Отработана модель черепно-мозговой раны на кроликах. Отработан метод забора костного мозга из подвздошных костей кролика, метод выделения и культивирования стромальных стволовых клеток из этой популяции, проведены эксперименты по введению указанных клеток в модельную черепно-мозговую рану, проведен гистологический анализ формирования регенерирующей костной ткани в области раны у контрольных и опытных животных. Получены экспериментальные данные, подтверждающие ускорение и более качественное формирование костной ткани при заживлении раны с использованием стромальных клеток из костного мозга изологичного животного. Проведен патентный поиск отечественных и зарубежных изобретений с использованием культивируемых клеток для восстановления кожных покровов. Вышла из печати 1 статья и 1 статья подготовлена к публикации.
Развернуть
4
01.04.2006 - 30.06.2006
Отработан наиболее оптимальный способ введения эндотелиальных клеток человека в дермальный эквивалент на основе фибринового геля с образованием капилляроподобных структур. В экспериментах на модельных черепных ранах кролика показано, что восстановление костной ткани в результате трансплантации заключенных в коллагеновый гель стромальных клеток костного мозга происходит полностью за 120 суток по сравнению с вариантом, где в рану вводилась только суспензия таких же клеток. Показана возможность обогащения стволовыми клетками популяции базальных кератиноцитов человека путем адгезии их на субстрат из коллагена и фибронектина, в отличие от других белков внеклеточного матрикса – ламинина 2/4 и комплекса матригеля. Отработан способ формирования биодеградируемой пористой полимерной матрицы на основе полилактида с участием полиэтиленгликоля, способ модификации поверхности такой матрицы коллагеном раных форм – фибриллярной и молекулярной; показано, что для роста кератиноцитов наиболее оптимальной является модификация поверхности фибриллярной формой коллагена.
Развернуть
5
01.07.2006 - 31.10.2006
Результаты, полученные при выполнении работ по 5-му этапу, показали принципиальную возможность формирования трехмерной композиции из белков внеклеточного матрикса не только на основе коллагена, но и на основе фибрина плазмы крови человека. Это дает определенную предпосылку использования в заместительной терапии для заживления ран клеточных продуктов, приготовленных из клеток и белков пациента. Задача по разработке резорбируемых субстратов на основе полилактидов в композиции с коллагеном, предназначенных для культивирования клеток кожи человека, с максимально щадящим сохранением свойств этих клеток в процессе трансплантации их на раневую поверхность выполнена на современном мировом уровне и в полном соответствии с Техническим заданием.
Получено утверждение Технических условий на клеточный продукт «Эквивалент дермальный, ЭД» и Регистрационное удостоверение Росэпиднадзора РФ на серийное производство и клиническое применение этого продукта.
Оформляется патент по результатам исследований о создании биодеградируемых матриц для культивирования клеток кожи.
Опубликованы 3 статьи
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы

Программное мероприятие

1.3 Прикладные разработки в рамках системы приоритетных направлений
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
17,6 млн
Организация
ИБР РАН
профинансировано
Продолжительность работ
2012 - 2013, 15 мес.
Бюджетные средства
2,99 млн
Организация
ИБМХ
профинансировано
Продолжительность работ
2012, 1 мес.
Бюджетные средства
2,7 млн
Организация
ИМБ РАН
профинансировано
Тема
Метод восстановления эпителиально-мезенхимальных дефектов с помощью стволовых клеток
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
7,5 млн
Количество заявок
5
Тема
Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток.
Продолжительность работ
2014 - 2016, 28 мес.
Бюджетные средства
48 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка методов восстановления нервной ткани мозга и сетчатки глаза дедифференцированными клетками ретинального пигментного эпителия при нейродегенеративных заболеваниях человека.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка способа восстановления мужской репродуктивной функции с помощью аутологичных и аллогенных культур стволовых и прогениторных клеток.
Продолжительность работ
2009 - 2010, 17 мес.
Бюджетные средства
7 млн
Количество заявок
3
Тема
Разработка метода получения биосовместимых трехмерных матриксов на основе рекомбинантных аналогов белков шелка для использования в тканевой инженерии.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 18 мес.
Бюджетные средства
12 млн
Количество заявок
1