Регистрация / Вход
Прислать материал

Использование прогениторных клеток, несущих регулируемые уровнем кислорода генные конструкции, для восстановления кровоснабжения в ишемических органах.

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Выполнение этапа проекта
Проект
02.435.11.3022
Организация
ИМБ РАН

разработать новые технологии для восстановления кровообращения в ишемизированных тканях мозга, сердца и скелетных мышц с помощью введения в них прогениторных клеток, несущих регулируемые генетические конструкции, продуцирующие высокие уровни про-ангиогенных факторов в условиях недостатка кислорода.

Соисполнители

Этапы проекта

1
01.10.2005 - 08.12.2005
Проведено создание 25 базовых вариантов плазмидных генетических конструкций, индуцируемых низкими уровнями кислорода. Создано 12 дополнительных генетических конструкций с измененными промоторами и сайтами полиаденилирования и 4 дополнительные конструкции за счет использования вариантов минимального промотора гена альфа тяжелой цепи миозина.Проведено секвенирование полученных конструктов для проверки правильности последовательностей ДНК. Отработан метод исследования активности полученных конструкций на животных и проведено исследование параметров функцианирования плазмидных конструкций при гипоксии. проведена селекция эффективных вариантов индуцируемых гипоксией конструкций. Отработаны различные методы флюоресцентного мечения прогенеторных клеток.
Развернуть
2
01.01.2006 - 30.06.2006
Проведена отработка методов введения генетических конструкций в мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани и костного мозга с помощью плазмидных и вирусных векторов, доказана возможность достижения терапевтически приемлемых уровней введения конструкций. Проведено клонирование ряда терапевтических генов в целевые экспрессионные вектора – плазмидные, аденоассоциированные вирусные и лентивирусные. В число клонированных генов входят Ang1, HGF, VEGF165, миниген VEGF, FGF-2, eNOS и HIF-1a. Получен ряд вариантов этих конструкций, содержащих контролирующие модули, индуцируемые низким уровнем кислорода. Отработаны способы введения мезенхимальных стволовых клеток в ишемизированные мышцы задней конечности и миокард, и налажены процедуры анализа распределения трансплантированных клеток, их выживания и миграции. Проведено введение терапевтической конструкции, экспрессирующей ген VEGF, в мезенхимальные стволовые клетки, и показан высокий уровень экспрессии VEGF этим клеточным препаратом. Разработаны протоколы выделения и культивирования мезенхимальных стволовых клеток, введения в них генетических конструкций, анализа распределения и выживания трансплантированных клеток в ишемизированных органах.
Развернуть
3
01.07.2006 - 31.10.2006
В ходе выполнения третьего этапа проводились дополнительные отработки методов введения генетических конструкций в мезенхимальные стволовые клетки. Была исследована работа новых вариантов индуцируемых конструкций, содержащих модифицированный минимальный промотор гена тяжелых цепей миозина, и показана их более высокая эффективность по сравнению с использованными ранее конструкциями с минимальным промотором SV40. Были созданы дополнительные варианты индуцируемых конструкций, содержащих гены VEGF165, VEGF, Ang1 (ангиопоэтин 1), HGF и FGF-2, обеспечивающих лучшие условия индукции и экспрессии генов при гипоксии в культуре по сравнению с использованными ранее. Проводились испытания опытных образцов прогениторных клеток (мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани). Было показано, что уровень экспрессии маркерного гена в мезенхимальных стволовых клетках жировой ткани (МСК ЖТ), в зависимости от использованной генетической конструкции, возрастает в 5-50 раз в условиях гипоксии (1 % О2). Показано что уровень секреции VEGF в среду культивирования при введении регулируемых уровнем кислорода плазмид c геном VEGF165 в прогениторные клетки (МСК ЖТ) возрастает в 4-10 раз в условиях гипоксии, и снижается не менее чем в 3 раза после помещения таких клеток в условия нормоксии; оба значения соответствуют параметрам технического задания. Наилучшие из созданных образцов плазмидных генетических конструкций, регулируемых уровнем кислорода, по критериям величины индукции и уровня экспрессии при гипоксии превосходят имеющиеся мировые аналоги.
Была исследована ангиогенная эффективность прогениторных клеток (МСК ЖТ), несущих генные конструкты, экспрессирующие VEGF165, на модели васкуляризации подкожного имплантата матригеля у иммунодефицитных мышей. Показано увеличение стимуляции ангиогенеза и артериогенеза клетками, содержащими плазмиды, по сравнению немодифицированными клетками. На модели критической ишемии нижних конечностей мышей показано, что МСК ЖТ, содержащие плазмиды VEGF165, дают дополнительный терапевтический эффект по сравнению с контрольными клетками.
В ходе проведенных исследований не было выявлено каких-либо существенных побочных эффектов применения клеток, содержащих плазмидные конструкции.
Были проведены патентные исследования и поданы 2 заявки на патенты по тематике работы.
Развернуть

Программа

Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы

Программное мероприятие

1.3 Прикладные разработки в рамках системы приоритетных направлений
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
4,5 млн
Организация
ИБХ РАН
профинансировано
Тема
Использование прогениторных клеток, несущих регулируемые уровнем кислорода генные конструкции, для восстановления кровоснабжения в ишемических органах
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Количество заявок
4
Тема
Разработка методов подавления или стимуляции роста кровеносных сосудов с помощью рекомбинантных белков и модифицированных клеток, продуцирующих ангиогенные белки.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
18 млн
Количество заявок
5
Тема
Разработка способа восстановления мужской репродуктивной функции с помощью аутологичных и аллогенных культур стволовых и прогениторных клеток.
Продолжительность работ
2009 - 2010, 17 мес.
Бюджетные средства
7 млн
Количество заявок
3
Тема
Разработка метода применения рекомбинантных генетических конструкций, экспрессирующих гены ангиогенных факторов роста, для терапии заболеваний, обусловленных недостаточным кровоснабжением тканей и органов
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
19 млн
Количество заявок
2
Тема
Использование стволовых и прогениторных клеток из соматических тканей человека для восстановительной терапии и регенерации тканей
Продолжительность работ
2007 - 2009, 30 мес.
Бюджетные средства
210 млн
Количество заявок
2