Биолюминесцентный анализ: биосенсоры и биокаталитические технологии

1. Проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к методам мониторинга биологических объектов, разработкам биорепортерных сенсоров, сенсоров на основе светящегося мицелия грибов, способам получения иммобилизованных биосенсоров; 2. Организованы и ведутся патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96; 3. Проведена систематизация закономерностей воздействия на биолюминесцентные системы различных групп соединений (органических и неорганических окислителей и восстановителей - тяжелых атомов: галоидов и металлов, включая радиоактивные, углеводородов нефти, пестицидов и др.); 4. Сформулированы возможные направления разработки биолюминесцентных сенсоров для анализа воздействия окружающей среды на биологические объекты и их проведена их сравнительная оценка; 5. Сформулированы основные принципы создания биолюминесцентных систем непрерывного действия; 6. На основании проведенного анализа данных произведен выбор способа иммобилизации клеток и ферментов светящихся бактерий как биологической части биолюминесцентного сенсора; 7. Получены мутантные варианты фотопротеина обелина с измененными характеристиками биолюминесценции и изучены их основные физико-химические свойства.

1. Проведен скрининг наиболее длительно светящихся природных штаммов бактерий и найдены штаммы, способные сохранять равномерное свечение до 16 суток при комнатной температуре и до 23-х суток при 4°С. Показано, что смешанные культуры весьма перспективны для получения лиофилизированных препаратов с увеличенным периодом свечения и расширенными температурными пределами измерений. Установлено, что лиофилизированные бактериальные культуры в принципе являются наиболее чувствительным к действию токсикантов тест-объектом;
2. .Исследованы 27 культур грибов видов Armillaria cepistipes, Armillaria gallica, Armillaria mellea, Armillaria sp., Armillaria tabescens, Lampteromyces japonicus, Panellus stypticus на способность светиться. Показано, что один из светящихся видов – A. mellea – может быть использован в качестве тест-объекта в биолюминесцентном анализе;
3. Проведены эксперименты по иммобилизации светящихся бактерий в поливиниловые гели разной концентрации. Показано, что в результате криополимеризации эти гели теряют прозрачность, что снижает интенсивность измеряемого сигнала бактерий на 2 порядка. Таким образом, в нашем случае, когда проходимость светового сигнала – критически важный фактор, этот реагент не является подходящей средой для иммобилизации.
4. Определены условия иммобилизации биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза в полимерные гели, обеспечивающие высокий выход активности ферментов (90-100 %).
5. Проведены исследования по получению многокомпонентного иммобилизованного реагента и установлен его оптимальный состав: НАДН НАДН:ФМН-оксидоредуктаза, люцифераза, альдегид и НАДН. Исследовано влияние гелевого окружения на стабильность ферментов и их физико-химические характеристики. Показано, что по сравнению с биферментной системой в растворе, иммобилизованная биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза обладает повышенной устойчивостью и термостабильностью, расширенным диапазоном оптимумов рН и ионной силы раствора и т.д.
6. Разработан новый биолюминесцентный метод оценки эффективности действия различных детоксицирующих факторов – гуминовых веществ, биологических агентов (микроскопических грибов), ультрафиолетового излучения.
7. Изучены свойства ряда мутантных производных фотопротеина обелина и отобраны наиболее пригодные (по активности, стабильности и спектральным характеристикам биолюминесценции) для использования в качестве репортеров в иммуноферментном анализе. Синтезированы «цветные метки» – высокоактивные коньюгаты этих мутантов с антителами на β-субъединицы лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов.
8. Сконструирован и проведен одновременный твердофазный биолюминесцентный иммуноанализ этих гормонов в стандартных и контрольных сыворотках. Регистрацию сигналов от каждой метки проводили одновременно двумя ФЭУ через соответствующие оптические фильтры. Получены удовлетворительные результаты измерений гормонов в контрольных сыворотках.
9. Составлен аналитический отчет по результатам патентно-информационного поиска

1. Проведены дополнительные исследования и найдены условия, позволяющие существенно увеличить чувствительность иммобилизованных биолюминесцентных реагентов к действию ряда поллютантов; 2. Проведена успешная апробация метода биолюминесцентного тестирования сточных вод Енисейского ЦБК с использованием иммобилизованных реагентов; 3. Подготовлены документы для сертификации метода биолюминесцентного тестирования водных экосистем с использованием иммобилизованных реагентов; 4. Разработаны регламенты 2-х биолюминесцентных методов: а) мониторинга токсичности радиоактивных изотопов и б) оценки эффективности детоксицирующих факторов в растворах оксидантов; 4. Показано, что наиболее подходящей средой для иммобилизации светящихся бактерий является гель альгината калия. Иммобилизованный в него препарат светящихся бактерий P. phosphoreum успешно использован для тестирования наличия модельных токсикантов в газовой фазе; 5. Исследовано действие ряда токсикантов (органических и неорганических) на свечение культур 3-х видов светящихся грибов (Armillaria borealis , Armillaria mellea и Lampteromyces japonicus) и показано, что светящиеся грибы могут быть успешно использованы в качестве тест-объектов в биолюминесценом сигнализаторе пролонгированного действия; 6. Разработан наиболее эффективный пролонгированный бактериальный биолюминесценый тест-объект для определения токсичности водной и газовой сред и на его основе сконструирован прототип биолюминесцентного сигнализатора непрерывного действия; 7. По проведенным исследованиям чувствительность разрабатываемого биолюминесцентного одновременного иммуноанализа фолликулстимулирующего (0,55 МЕд/л) и лютеинизирующего (0, 48 МЕд/л) гормонов, не уступает раздельным радиоизотопному и иммуноферментному анализам; 8. Предложены необходимые конструктивные изменения в схемах биолюминометров при использовании иммобилизованных биотестов (ферментов, бактериальных клеток), мицелия грибов, а также при одновременном иммуноанализе двух аналитов; 9. Составлен заключительный отчет по результатам патентно-информационного поиска. Подана заявка на изобретение «Биолюминесцентный способ определения антиоксидантной активности гуминовых веществ» №2007 124565 от 29.06.2007; 10. Проведен анализ полученных результатов за весь период работ в рамках проекта.