Разработка вирусспецифических реагентов на основе TiO2 наночастиц, содержащих активный лиганд, для направленного расщепления вирусного генома, включая вирус гриппа птиц
Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.512.11.2081
Организация
Новосибирский государственный университет, НГУ
Руководитель работ
Загребельный Станислав Николаевич
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
17,6 млн
Внебюджетные средства
4 млн
Работы должны проводиться в рамках критической технологии «Геномные и посттеномные технологии создания лекарственных средств» Работы должны соответствовать по предполагаемому исполнению лучшим мировым стандартам. В результате выполнения каждой работы должен быть создан необходимый потенциал, обеспечивающий переход к проведению опытно-конструкторских работ с целью последующей коммерциализации. Результаты работ должны способствовать дальнейшему инновационному развитию российских технологий в данном приоритетном направлении Программы.
Соисполнители
Организация
ФБУН ГНЦ ВБ "ВЕКТОР" РОСПОТРЕБНАДЗОРА
Организация
ИХБФМ СО РАН
Организация
Институт катализа СО РАН, ИК СО РАН,
Этапы проекта
1
05.04.2007 - 01.09.2007
Краткое описание выполненных работ:
Исследовано влияние условий синтеза наночастиц TiO2 на дисперсность TiO2. Отработаны методы определения размеров наночастиц TiO2. Разработаны методы получения наночастиц TiO2 требуемого размера (3-5 нм);
Разработаны методы синтеза производных олигонуклеотидов, адресованных к структуре генома вируса диареи крупного рогатого скота, избранного в качестве модели вируса гепатита. Отработаны условия иммобилизации олигонуклеотидов на TiO2-наночастицы.
Исследована гибридизация олигонкулеотидов, иммобилизованных на наночастицах TiO2. Показано, что гибридизация с мишенями протекает специфически и способствует их расщеплению под действием УФ-облучения;
Исследована проницаемость клеток линий Vero, MDCK и КСТ для наночастиц и их кньюгатов. Показано, что наночастицы TiO2.и их коньюгаты с олигонуклеотидами проникают в клетки, локализуясь преимущественно в цитоплазме в виде отдельных частиц и агрегатов;
Проверена цитотксичность наночастиц TiO2 на культурах клеток линий Vero, MDCK и КСТ. Показано, что наночастицы TiO2 и их коньюгаты с олигонуклеотидами обладают низкой цитотоксичностью по отношению к клеткам линий Vero и КСТ и несколько более заметной цитотоксичностью по отношению к клеткам линии MDCK;
Исследована способность коньюгата ингибировать вирусную активность BVDV на культурах клеток. Показано, что коньюгаты наночастиц TiO2 с олигонуклеотидами обладают противовирусной активностью на культурах клеток линий Vero и КСТ;
Подготовлен промежуточный отчет по этапу.
Исследовано влияние условий синтеза наночастиц TiO2 на дисперсность TiO2. Отработаны методы определения размеров наночастиц TiO2. Разработаны методы получения наночастиц TiO2 требуемого размера (3-5 нм);
Разработаны методы синтеза производных олигонуклеотидов, адресованных к структуре генома вируса диареи крупного рогатого скота, избранного в качестве модели вируса гепатита. Отработаны условия иммобилизации олигонуклеотидов на TiO2-наночастицы.
Исследована гибридизация олигонкулеотидов, иммобилизованных на наночастицах TiO2. Показано, что гибридизация с мишенями протекает специфически и способствует их расщеплению под действием УФ-облучения;
Исследована проницаемость клеток линий Vero, MDCK и КСТ для наночастиц и их кньюгатов. Показано, что наночастицы TiO2.и их коньюгаты с олигонуклеотидами проникают в клетки, локализуясь преимущественно в цитоплазме в виде отдельных частиц и агрегатов;
Проверена цитотксичность наночастиц TiO2 на культурах клеток линий Vero, MDCK и КСТ. Показано, что наночастицы TiO2 и их коньюгаты с олигонуклеотидами обладают низкой цитотоксичностью по отношению к клеткам линий Vero и КСТ и несколько более заметной цитотоксичностью по отношению к клеткам линии MDCK;
Исследована способность коньюгата ингибировать вирусную активность BVDV на культурах клеток. Показано, что коньюгаты наночастиц TiO2 с олигонуклеотидами обладают противовирусной активностью на культурах клеток линий Vero и КСТ;
Подготовлен промежуточный отчет по этапу.
2
02.09.2007 - 31.12.2007
На втором этапе работы, в соответствии с календарным планом продолжались исследования, начатые на первом этапе, в том числе:
• Исследование влияния стабилизирующих добавок на время жизни коллоидных TiO2-наночастиц;
• Исследование текстурных и структурных свойств TiO2-наночастиц методами БЭТ, РФА, СЭМ, ПЭМ, МУРР;
• Разработка методов синтеза производных олигонуклеотидов, адресованных к структуре гена белка NP вируса гриппа А и их иммобилизация на TiO2 наночастицы;
• Исследование способности коньюгатов TiO2-наночастиц с олигонуклеотидами ингибировать вирусную активность гриппа А (штаммы H3N2 и H5N1) на культуре клеток MDCK.
Кроме того, продолжалась работа по поиску и анализу патентной литературы с целью поиска путей защиты интеллектуальной собственности, созданной в процессе выполнения работы по теме проекта.
В результате работы:
• Показано, что TiO2-наночастицы, полученные с использованием данных работ этапа 1, сохраняют в суспензиях характеристики, достигнутые при подборе условий синтеза (размер частиц в присутствии стабилизатора МКЦ сохраняется в пределах 4-5 нм), что соответствует требованиям Технического задания. (работы выполнены в Институте катализа СО РАН).
• Синтезированы полиамин-содержащие олигонуклеотиды, комплементрарные выбранным консервативным участкам генома вируса гриппа, PA-oligo (PA – полиамин) (работы выполнены в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).
• Продемонстирировано проникновение TiO2-наночастиц и нанокомпозитов в культивируемые эукариотические клетки различных линий, независимо от природы олигонуклеотидных компонентов коньюгатов (работы выполнены в Новосибирском государственном университете)
• Нанокомпозиты на основе наночастиц TiO2–полилизин–олигонуклеотид в форме анатаз обладали противовирусной активностью по отношению к вирусам гриппа H3N2 и H5N1, на которые они и были адресованы (работы выполнены в Федеральном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»); эффект зависит от структуры олигонуклеотида.
• Подготовлен отчет о патентных исследованиях по ГОСТ 15.011-96
• Исследование влияния стабилизирующих добавок на время жизни коллоидных TiO2-наночастиц;
• Исследование текстурных и структурных свойств TiO2-наночастиц методами БЭТ, РФА, СЭМ, ПЭМ, МУРР;
• Разработка методов синтеза производных олигонуклеотидов, адресованных к структуре гена белка NP вируса гриппа А и их иммобилизация на TiO2 наночастицы;
• Исследование способности коньюгатов TiO2-наночастиц с олигонуклеотидами ингибировать вирусную активность гриппа А (штаммы H3N2 и H5N1) на культуре клеток MDCK.
Кроме того, продолжалась работа по поиску и анализу патентной литературы с целью поиска путей защиты интеллектуальной собственности, созданной в процессе выполнения работы по теме проекта.
В результате работы:
• Показано, что TiO2-наночастицы, полученные с использованием данных работ этапа 1, сохраняют в суспензиях характеристики, достигнутые при подборе условий синтеза (размер частиц в присутствии стабилизатора МКЦ сохраняется в пределах 4-5 нм), что соответствует требованиям Технического задания. (работы выполнены в Институте катализа СО РАН).
• Синтезированы полиамин-содержащие олигонуклеотиды, комплементрарные выбранным консервативным участкам генома вируса гриппа, PA-oligo (PA – полиамин) (работы выполнены в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).
• Продемонстирировано проникновение TiO2-наночастиц и нанокомпозитов в культивируемые эукариотические клетки различных линий, независимо от природы олигонуклеотидных компонентов коньюгатов (работы выполнены в Новосибирском государственном университете)
• Нанокомпозиты на основе наночастиц TiO2–полилизин–олигонуклеотид в форме анатаз обладали противовирусной активностью по отношению к вирусам гриппа H3N2 и H5N1, на которые они и были адресованы (работы выполнены в Федеральном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»); эффект зависит от структуры олигонуклеотида.
• Подготовлен отчет о патентных исследованиях по ГОСТ 15.011-96
3
01.01.2008 - 30.06.2008
Синтезированы коньюгаты TiO2-ODN-тетрафторарилазид и переданы на испытания противирусной активности.
Проведена проверка активности клеточных РНКаз, на модельных системах (очищенная фосфодиэстераза змеиного яда – экзонуклеаза – и лизат клеток Vero
Продемонстрирована способность коньюгатов подавлять действие вирусов гриппа А и BVDV на культурах клеток.
Написаны исходные данные и прописи для регламента на приготовление наночастиц диоксида титана.
Наработаны опытные партии наночастиц диоксида титана и коньюгатов.
Проведена проверка активности клеточных РНКаз, на модельных системах (очищенная фосфодиэстераза змеиного яда – экзонуклеаза – и лизат клеток Vero
Продемонстрирована способность коньюгатов подавлять действие вирусов гриппа А и BVDV на культурах клеток.
Написаны исходные данные и прописи для регламента на приготовление наночастиц диоксида титана.
Наработаны опытные партии наночастиц диоксида титана и коньюгатов.
4
01.07.2008 - 31.10.2008
Синтезированы блеомициновые производные олигонуклеотидов комплементарных выбранным фрагментам генома вируса гриппа А подтипов H3N2 и вирусу диареи крупного рогатого скота (BVDV). Получены коньюгаты блеомициновых производных олигонуклеотидов с наночастицами TiO2. Показано проникновение наноконьюгатов, содержащих блеомицин, в клетки.
  Исследована цитотоксичность блеомицин-содержащих наноконьюгатов и их противовирусная активность.
  Исследована цитотоксичность блеомицин-содержащих наноконьюгатов и их противовирусная активность.
Программа
Программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы"
Программное мероприятие
1.2 Проведение проблемно-ориентированных поисковых исследований и создание научно-технического задела по технологиям в области наук о жизни
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
17,6 млн
Организация
ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России
профинансировано
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
17,6 млн
Организация
ФГБУ "НМИЦ кардиологии" Минздрава России
профинансировано
Продолжительность работ
2007 - 2008, 18 мес.
Бюджетные средства
17,6 млн
Организация
ФГБУ ГНЦ МИНЗДРАВА РОССИИ
профинансировано
профинансировано
профинансировано