Разработка вирусспецифических реагентов на основе TiO2 наночастиц, содержащих активный лиганд, для направленного расщепления вирусного генома, включая вирус гриппа птиц

Краткое описание выполненных работ:
Исследовано влияние условий синтеза наночастиц TiO2 на дисперсность TiO2. Отработаны методы определения размеров наночастиц TiO2. Разработаны методы получения наночастиц TiO2 требуемого размера (3-5 нм);
Разработаны методы синтеза производных олигонуклеотидов, адресованных к структуре генома вируса диареи крупного рогатого скота, избранного в качестве модели вируса гепатита. Отработаны условия иммобилизации олигонуклеотидов на TiO2-наночастицы.
Исследована гибридизация олигонкулеотидов, иммобилизованных на наночастицах TiO2. Показано, что гибридизация с мишенями протекает специфически и способствует их расщеплению под действием УФ-облучения;
Исследована проницаемость клеток линий Vero, MDCK и КСТ для наночастиц и их кньюгатов. Показано, что наночастицы TiO2.и их коньюгаты с олигонуклеотидами проникают в клетки, локализуясь преимущественно в цитоплазме в виде отдельных частиц и агрегатов;
Проверена цитотксичность наночастиц TiO2 на культурах клеток линий Vero, MDCK и КСТ. Показано, что наночастицы TiO2 и их коньюгаты с олигонуклеотидами обладают низкой цитотоксичностью по отношению к клеткам линий Vero и КСТ и несколько более заметной цитотоксичностью по отношению к клеткам линии MDCK;
Исследована способность коньюгата ингибировать вирусную активность BVDV на культурах клеток. Показано, что коньюгаты наночастиц TiO2 с олигонуклеотидами обладают противовирусной активностью на культурах клеток линий Vero и КСТ;
Подготовлен промежуточный отчет по этапу.

На втором этапе работы, в соответствии с календарным планом продолжались исследования, начатые на первом этапе, в том числе:
• Исследование влияния стабилизирующих добавок на время жизни коллоидных TiO2-наночастиц;
• Исследование текстурных и структурных свойств TiO2-наночастиц методами БЭТ, РФА, СЭМ, ПЭМ, МУРР;
• Разработка методов синтеза производных олигонуклеотидов, адресованных к структуре гена белка NP вируса гриппа А и их иммобилизация на TiO2 наночастицы;
• Исследование способности коньюгатов TiO2-наночастиц с олигонуклеотидами ингибировать вирусную активность гриппа А (штаммы H3N2 и H5N1) на культуре клеток MDCK.
Кроме того, продолжалась работа по поиску и анализу патентной литературы с целью поиска путей защиты интеллектуальной собственности, созданной в процессе выполнения работы по теме проекта.
В результате работы:
• Показано, что TiO2-наночастицы, полученные с использованием данных работ этапа 1, сохраняют в суспензиях характеристики, достигнутые при подборе условий синтеза (размер частиц в присутствии стабилизатора МКЦ сохраняется в пределах 4-5 нм), что соответствует требованиям Технического задания. (работы выполнены в Институте катализа СО РАН).
• Синтезированы полиамин-содержащие олигонуклеотиды, комплементрарные выбранным консервативным участкам генома вируса гриппа, PA-oligo (PA – полиамин) (работы выполнены в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).
• Продемонстирировано проникновение TiO2-наночастиц и нанокомпозитов в культивируемые эукариотические клетки различных линий, независимо от природы олигонуклеотидных компонентов коньюгатов (работы выполнены в Новосибирском государственном университете)
• Нанокомпозиты на основе наночастиц TiO2–полилизин–олигонуклеотид в форме анатаз обладали противовирусной активностью по отношению к вирусам гриппа H3N2 и H5N1, на которые они и были адресованы (работы выполнены в Федеральном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»); эффект зависит от структуры олигонуклеотида.
• Подготовлен отчет о патентных исследованиях по ГОСТ 15.011-96

Синтезированы коньюгаты TiO2-ODN-тетрафторарилазид и переданы на испытания противирусной активности.
Проведена проверка активности клеточных РНКаз, на модельных системах (очищенная фосфодиэстераза змеиного яда – экзонуклеаза – и лизат клеток Vero
Продемонстрирована способность коньюгатов подавлять действие вирусов гриппа А и BVDV на культурах клеток.
Написаны исходные данные и прописи для регламента на приготовление наночастиц диоксида титана.
Наработаны опытные партии наночастиц диоксида титана и коньюгатов.

Синтезированы блеомициновые производные олигонуклеотидов комплементарных выбранным фрагментам генома вируса гриппа А подтипов H3N2 и вирусу диареи крупного рогатого скота (BVDV). Получены коньюгаты блеомициновых производных олигонуклеотидов с наночастицами TiO2. Показано проникновение наноконьюгатов, содержащих блеомицин, в клетки.
  Исследована цитотоксичность блеомицин-содержащих наноконьюгатов и их противовирусная активность.