Белки-биосенсоры как основа для разработки подходов к диагностике заболеваний человека, связанных с повреждением ДНК и нарушением метаболизма селена

Проведен анализ научно-технической литературы, относящейся к разрабатываемой теме. Сконструированы и синтезированы олигонуклеотиды для создания апуриновых/апиримидиновых ДНК, применяемых в качестве химически активных ДНК-зондов для регистрации исследуемых белков репарации ДНК. Выделены в высокоочищенном состоянии рекомбинантные – поли(АDP-рибозо)полимераза 1 (PARP1) и XRCC1 (белок, входящий в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению). Получен цельноклеточный экстракт из клеток HeLa. Определены эффективности присоединения АП-ДНК различной структуры к очищенной рекомбинантной XRCC1. Показано, что АП-ДНК с одноцепочечными разрывами обеспечивают большие уровни модификации белка. Определены эффективности присоединения АП-ДНК, содержащих напротив АП-сайта ненуклеотидные вставки, имитирующие АП-сайт, к очищенной рекомбинантной PARP1 и влияние апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 на этот процесс. Определены эффективности присоединения АП-ДНК различной структуры к Ku80 субъединице к Ku-антигена в экстракте из клеток HeLa. На основании полученных данных сделаны предварительные выводы о структуре оптимальных АП-ДНК-зондов.

За отчётный период проведён расчёт и созданы ДНК-конструкции, позволяющих синтезировать модельные РНК-транскрипты, содержащие фрагмент мРНК, включающий селеноцистеиновый кодон, SECIS-элемент и спейсерную часть между ними, различающиеся природой SECIS-элемента и длиной спейсерной части. Изучено связывание модельных РНК с изолированными рибосомами человека и с рибосомами в составе бесклеточной белок-синтезирующей системы из ретикулоцитов кролика в присутствии белка SBP2. Выбраны оптимальные условия связывания (концентрации компонентов и ионов Mg2+ и состав буфера).

Разработаны ДНК-зонды для поиска мутаций в районе гена белка SBP2, который соответствует участку связывания белка с 60S рибосомной субчастицы.
  В ходе выполнения проекта проведены ориентированные фундаментальные исследования, направленные на создание и применение методов тестирования статуса систем репарации ДНК в клетках человека в норме и при патологии.