Совместные российско-французские исследования по созданию медико-биологических приложений технологии биочипов: генотипирование вируса гепатита С, обеспечивающее индивидуальный подбор терапии, и развитие метода параллельного анализа белков в биологических образцах с помощью масс-спектрометрии

1. Проведен анализ научно-технической литературы, нормативно-технической документации и других материалов, относящихся к теме разработки методик генотипирования вируса гепатита С (ВГС), подготовлен перечень результатов интеллектуальной деятельности;
2. Сконструировано множественное выравнивание последовательностей исследуемого региона генома ВГС для всех известных генотипов и подтипов (всего более 2000 последовательностей). На основании созданного выравнивания выбраны пилотные варианты последовательностей праймеров для амплификации фрагмента области NS5B и зонды для идентификации 6 генотипов и 36 подтипов ВГС.
3 Выполнен синтез, очистка и включение флуоресцентной метки праймеров для реакций обратной транскрипции и амплификации. Проведены синтез и очистка набора олигонуклеотидов для иммобилизации на биочипе.
4 Изготовлены пилотные серии биочипов для идентификации генотипов и подтипов ВГС путем нанесения растворов синтезированных олигонуклеотидов на пластиковые подложки микрочипа. Проведена проверка пилотных серий биочипов на предмет равномерности нанесения гелевых элементов, а также оценка концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов в ячейках биочипа.
5 Предложено использование электропроводящих подложек с золотым напылением с целью увеличения сигналов и улучшения разрешения пиков в масс-спектрометрическом методе анализа белковых взаимодействия на биочипах. Проведена оценка степени иммобилизации белков в гелевых элементах микрочипа на подложках различных типов.
6 Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96.

Произведен отбор и селекция клонов продуцентов генно-инженерных наноантител, распознающих ФРЭС из имеющейся библиотеки одноцепочечных антител.Получена белковая субстанция наноантител, специфически связывающих фактор роста эндотелия сосудов.
Создана in vitro тест-система для высокопроизводительного анализа блокаторов биологической активности фактора роста эндотелия сосудов.
Осуществлен выбор индивидуальных наноантител, способных блокировать биологическую активность ФРЭС. Проведен сравнительный анализ распределения антител к ФРЭС в тканях. Осуществлена обработка экспериментальных данных. Проведена наработка наноантител.

Проведена оптимизация процедур амплификации и гибридизации разработанной методики
  Проведен подбор отечественных ферментов для проведения стадии обратной транскрипции, совмещенной с ПЦР (ОТ-ПЦР.
  Оптимизирован температурно-временной режим стадии ОТ-ПЦР.
  Предложен алгоритм интерпретации флуоресцентной картины гибридизации на биочипе для идентификации генотипа и подтипа ВГС.
  Проведено тестирование иммобилизованных на биочипе специфичных олигонуклеотидов с использованием фрагментов кДНК, полученных при помощи разработанной процедуры ОТ-ПЦР с образцов РНК ВГС в качестве матрицы, предоставленных Лабораторией вирусологии Госпиталя Университета г. Тулуза (Франция).
  Проведено исследование 225 образцов из коллекции РНК ВГС, поддерживаемой в Лаборатории вирусологии с применением разработанного подхода и методики секвенирования фрагмента области NS5B с последующим филогенетическим анализом, используемой в качестве референсной

Проведен сравнительный анализ 345 образцов плазмы крови из Лаборатории вирусологии (г. Тулуза, Франция), содержащий вирус гепатита С с использованием разработанного метода генотипирования, с результатами прямого секвенирования региона NS5B.
  Показано, что разработанный метод способен выявлять клинически значимые, наиболее вирулентные и лекарственно-устойчивые разновидности ВГС с чувствительностью и специфичностью, равной 100%.
  Подготовлены заявки на патент РФ № 2008134981, приоритет от 29.08.2008 г «Тест-система для генотипирования вируса гепатита С»; № 2008138961, приоритет от 01.10.2008 «Реагенты для внутреннего флуоресцентного контроля при определении генотипа и подтипа вируса гепатита С на олигонуклеотидном микрочипе и способ получения таких реагентов».
  Проведен количественный масс-спектральный анализ белков, содержащих масс-метки, в смесях и образцах сыворотки крови.