Биолюминесцентные методы визуализации in vivo молекулярных процессов в клетках и целых организмах

С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза, получен набор мутантов обелина и акворина с заменами аминокислот (F88, M25, I144, F72, V118, E41, D133, I132, F119, L160 – в обелине и N33, F156 – в акворине), формирующих целентеразин-связывающую полость фотопротеинов;
  Для всех полученных мутантов обелина и акворина исследованы их основные физико-химические свойства
  Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получен двойной мутант обелина F88Y&F119W.
  Сконструированы плазмидные экспрессионные библиотеки кДНК генов из биолюминесцентной ткани двух светящихся гидромедуз.
  Проведен анализ патентной и научно-технической литературы.

Был осущест-влен сбор морского зоопланктона и зообентоса залива Нячанг Южно-Китайского моря.
  В результате скрининга библиотеки из Hal-istaura mitrocoma выделено восемь индивидуальных клонов, содержащих во-семь аллелей фотопротеина митрокомина.
  Определены нуклеотидные последо-вательности полноразмерных генов и проведен их сравнительный анализ. Из нуклеотидных последовательностей восстановлены аминокислотные последо-вательности изоформ митрокомина (п. 1.2).
  . На основе вектора pET22b сконструированы четыре экспрессион-ные конструкции, содержащие гены изоформ митрокомина, для их экспрессии в клетках E. coli (п. 1.3).
  Подобраны условия для рефолдинга, хроматографической очистки и активации четырех апоформ рекомбинантного митрокомина целентеразином.
  Получены высокоочищенные изоформы митрокомина в количествах, достаточ-ных для определения их основных физико-химических свойств.

Сконструирована экспрессионная к ДНК библиотека из тотального зоопланктона и проведен ее функциональный скрининг. Определена нуклеотидная последовательность кДНК гена, из которой восстановлена аминокислотная последовательность белка. Подобраны условия рефолдинга, хроматографической очистки и активации целентеразином вновь клонированного Са2+-регулируемого фотопротеина.

Разработана технология двухволновой детекции изменений кальция in vivo одновременно в митохондриях и цитоплазме клеток животных. Проведена проверка применимости полученных фрагментов целентеразин-зависимых люцифераз для разработки методов визуализации белок-белковых взаимодействий в модельных экспериментах in vivo на примере «лейцинового зиппера», «слитого» с фрагментами люциферазы. Разработана методика по применению технологии двухволновой детекции изменений кальция in vivo одновременно в митохондриях и цитоплазме клеток.Разработана методика по применению технологии визуализации in vivo белок-белковых взаимодействий, основанных на «комплементации» фрагментов обелина. Разработаны проекты ТЗ на проведение ОКР на разработку конструкторской и технологической документации на опытные образцы векторов для двухволновой детекции кальция и визуализации белок-белковых взаимодействий, а также изготовление опытных образцов и их испытания.