Разработка технологий и выпуск опытных партий синтетических и рекомбинантных белково-пептидных препаратов для коррекции патологических процессов и лечения социально значимых заболеваний

Проведена разработка способов получения рекомбинантных рИФНα-2b и рГ-КСФ, включающая оптимизацию соответствующих технологических процессов на этапе ренатурации целевых белков из телец включения и их очистку. Данные процессы позволяют не использовать культуральную жидкость производственных штаммов микроорганизмов при получении субстанций белков, что способствует увеличению качества субстанций в связи с возможностью высокой степени их очистки. В результате удалось на 5-10% увеличить содержание целевых белков в субстанциях рГ-КСФ и рИФНα-2b. К настоящему времени полностью уточнены требования к характеристике стандартного образца при получении рИФНα-2b и близки к завершению аналогичные исследования для рГ-КСФ.
Проведены исследования применимости твердофазного метода синтеза гептапептидов, обладающих опиоидной и анальгетической активностью. Исследованы два различных подхода к синтезу пептидил–полимера: использование традиционного набора Вос-производных аминокислот с последующим метиламидированием и гидрогенолизом продукта отщепления и использование стратегии Fmoc - производных с последующим метиламидированием и очисткой отщепленного полипептида. Получены пробные партии продукта, проводится оптимизация протоколов синтеза и очистки получаемых пептидов.

Проведена разработка способа повышения экономической эффективности получения рекомбинантного интерферон β-1b (рИФНβ-1b), включающего оптимизацию соответствующих технологических процессов на этапе ренатурации целевых белков из телец включения и их очистку. Способ позволяет увеличить выход целевого белка, степень его очистки и уменьшить себестоимость технологического процесса, благодаря использованию не применяемого ранее для этих целей детергента. Созданы лабораторные регламенты получения гранулоцитарного колониестимулирующий фактор (рГ-КСФ), интерферон α-2b (рИФНα-2b) и рИФНβ-1b. По сравнению с известными методами выделения указанных рекомбинантных белков разработанные нами способы позволяют на 10-15% увеличить выход целевых продуктов. Исследования биологической активности полученных белков на культурах клеток показали наличие активности, сопоставимой с эталонной.
2 Разработка методов получения синтетического пептидного препарата противоалкогольного действия
Разработаны условия очистки гептапептида противоалкогольного и анальгетического действия, полученного на 1 этапе работ твердофазным методом синтеза пептидов с применением Fmoc-защитных групп. Создан лабораторный регламент получения и очистки синтетического пептида, получено 25 г препарата, которые переданы в РНЦ РАМН для проведения фармакологических исследований

1. Апробировано три способа модификации рекомбинантных белков. Один из подходов касался разработки способа получения конъюгатов полисиаловой кислоты с целевым белком, который приводит к образованию сложных реакционных смесей, содержащих большое количество близкородственных продуктов, разделение которых на индивидуальные компоненты требует больших затрат исходного продукта. Другой подход подтвердил принципиальную возможность селективной модификации рекомбинантных белков по сульфгидрильной группе остатка Cys17 низкомолекулярными дисахаридными производными, что сопровождалось относительно низким выходом целевого продукта. Третий подход заключался в отказе от химических модификаций целевых белков и получении нековалентных нанокомплексов, в которых полисиаловая кислота выступала в роли наноносителя рИФН?-2b и рГ-КСФ, при этом отмечался высокий выход целевых белков и полное сохранение ими биологической активности. Разработаны лабораторные регламенты получения нековалентных нанокомплексов рИФН?-2b и рГ-КСФ с полисиаловой кислотой, создан задел для разработки опытно-промышленного регламента получения полисиалированных белков.
2. Разработан метод получения пентапептида, обладающего антидепрессивным действием и выбран оптимальный метод его очистки, создан лабораторный регламент получения и очистки препарата, получено и передано на испытания 50 г синтезированного пептида. Проведены испытания на эффективность и безопасность противоалкогольного гептапептида; показано, что пептид является препаратом средней токсичности, относится к классу психотропных веществ с выраженным действием на ЦНС, обладающим антиалкогольным, анальгетическим, психоседативным, и антипирогенным действием.

Проведено масштабирование синтеза белковых препаратов рИФН ?2b и рГ-КСФ человека, разработаны опытно-промышленные регламенты полу-чения их субстанций. Создана технология получения полисиалированного рИФН ?1b, основанная на оптимизированной методике рефолдинга и очист-ки целевого белка и инновационной технологии образования нековалентных нанокомплексов полисиаловой кислотой. Наработаны опытные партии суб-станций полисиалированных белков в количестве 9.8 – 10.2 г каждой суб-станции. Проведены испытания эффективности и безвредности полисиали-рованных белков. Показано, что в максимальной терапевтической дозе дан-ные препараты не оказывают токсического эффекта. Полисиалированные белки полностью сохраняют присущую им специфическую активность, ак-тивно влияя на пролиферацию клеток-респондентов. Испытания in vivo пока-зали, что полисиалирование увеличивает время полужизни белков в организ-ме мышей. Степень пролонгации для полисиалированных белков по сравне-нию с немодифицированными аналогами составила для интерферона альфа 34.4, для интерферона бета – 4.5, для рГ-КСФ – 2.8.
Проведены испытания антидепрессивных и противотревожных свойств пептидного препарата ИБХ-05ОН, а также его безопасности. Показано, пеп-тид является препаратом средней токсичности (LD50>1400 мг/кг), относится к классу психотропных веществ, с выраженным действием на ЦНС и облада-ет анксиолитическим, психоседативным, и противотревожным действием.