Выполнение работ по развитию ассоциации ЦКП «Биоинженерия» научным оборудованием (мероприятие Программы 5.2)

Разработана технологическая схема проведения поточного секвенирования геномных ДНК из различных источников. Исследована целесообразность дооснащения имеющихся специализированных комплексов (лабораторий)
научными приборами и оборудованием . Выбран автоматический секвенатор модель 454 фирмы «Roch».

1. Характеристика созданной научной (научно-технической, инновационной) продукции – объём не более 2 стр.

Крупномасштабное секвенирование ДНК различных природных объектов.
Объекты работы – геномные библиотеки гаплоидной линии картофеля RH и экстремофильной археи .
Цель работы – секвенирование ВАС-клонов геномной библиотеки, принад-лежащих 12 хромосоме картофеля, а также клональной библиотеки археи.
Для выполнения работы использовались следующие методы –ультразвуковая деградация ДНК, фракционирование деградированной ДНК при помощи электрофореза в геле агарозы, клонирование, выделение ДНК ВАС-клонов, секвенирование по Сэнгеру, первичный BLAST-анализ.
Метод выделения ДНК ВАС-клонов был специально разработан для выполнения договорных работ в рамках госконтракта № 02.512.11.2099 от 09 апреля 2007 г. Также разработаны технологические схемы проведения круп-номасштабного поточного секвенирования геномной ДНК и план-графики проведения работ.
В результате исследования получено первичных нуклеотидных последова-тельностей общим объемом 26 043 926 нуклеотидов, из них на долю библио-теки геномной ДНК картофеля приходится 13 860 652 нуклеотида, экстремо-фильной археи – 10 860 066 нуклеотидов и 1 197 208 нуклеотидов прочтено по завякам сторонних организаций, выполняющих работы по государствен-ным контрактам.
Проведена первичная аннотация и BLAST-анализ прочитанных после-довательностей и установлены гомологичные последовательности для 76 районов неизвестной ДНК картофеля линии RH.
Прочитанные последовательности геномной ДНК картофеля объедине-ны в 600 контигов общей длиной 1 398 227 нуклеотидов, то есть, с учетом чтения последовательностей клонирующего вектора и сопутствующих по-следовательностей, кратность чтения составляет не менее 6, что соответству-ет требованиям, применяемым в мировой практике при выполнении такого рода проектов.

2. Области и масштабы использования полученных результа-тов
Успешные исследования в области исследования организации и функ-ционирования живых систем на современном этапе развития науки возмож-ны только на основе создания комплексных технологий, обеспечивающих процесс всестороннего изучения фундаментальных основ организации живой материи и применения полученных результатов для нужд практического ис-пользования в различных областях, от биотехнологического производства до применения в здравоохранении для диагностики и лечения заболеваний.
Вся информации о любой живой системе, начиная с мельчайших виру-сов и бактерий и заканчивая высшими организмами, растенпиями и живот-ными, закодирована в генетическом материале этой системы. Поэтому ком-плексный подход к изучению функционирования геномов живых организмов должен включать все стадии исследования фунционирования генетической информации Базовым методом здесь, безусловно, является секвенирование ДНК. В настоящее время этот метод применяется не только для молекуляр-ной биологии и генетики, но и для вирусологии, микробиологии, зоологии, ботаники, эмбриологии, иммунологии и других фундаментальных биологи-ческих дисциплин. В медицине и прикладных медико-биологических иссле-дованиях анализ ДНК стал важным и необходимым методом ранней диагно-стики и мониторинга лечения рака, инфекционных и наследственных болез-ней человека. Решение многих задач связанных с биобезопасностью, в том числе и трансгенных организмов, геномной идентификацией и паспортизаци-ей личности невозможно без секвенирования ДНК. Секвенирование ДНК - обязательный компонент подавляющего большинства биотехнологий.
Процесс расшифровки геномов млекопитающих, растений и микроор-ганизмов активно развивается, и к настоящему моменту прочитано уже более двух сотен геномов различных организмов. Однако становится ясно, что только одного знания всех букв генетического кода, определение комплекса генов, необходимых для жизнедеятельности организма, недостаточно, к при-меру, для своевременной диагностики большинства заболеваний и подбора новых эффективных и высокоизбирательных лекарственных препара-тов.Процесс поточного секвенирования на современном высокопроизводи-тельном научном оборудовании выявил необходимость создания принципи-ально новой технологической схемы организации производства, начиная с этапа подготовки первичного генетического материала и заканчивая этапом компьютерной обработки полученных данных.
Молекулярно-биологические технологии являются одним из наиболее перспективных и успешно развивающихся направлений мировой и отечест-венной науки. Эти технологии представляют собою обширную и очень раз-нообразную группу методов предназначенных для исследования и анализа генома организмов (от бактерии до человека), выявления и идентификации вариаций в структуре исследуемого участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) вплоть до расшифровки и установления первичной последовательности его оснований. Основой молекулярно-биологических методов диагностики являются различной степени сложности технологические манипуляции с нуклеиновыми кислотами, предварительно экстрагированными из клеток и тканей организма. Однако современное развитие науки и практического здра-воохранения невозможно без создания новых технологий, позволяющих про-водить анализ множества генетических изменений одновременно. Кроме того, не менее важное значение имеет совершенствование и упрощение ме-тодов анализа биологического материала, что выражается в создании целого ряда диагностических наборов, основанных на современных технологиях и направленных на упрощение работы по диагностике заболеваний без потери качества и точности полученного результата. Одним из наиболее перспек-тивных методов для решения этой задачи является метод анализа на биоло-гических микрочипах.

Крупномасштабное секвенирование ДНК различных природных объектов.
Объекты работы – геномные библиотеки гаплоидной линии картофеля RH, экстремофильной археи, фотосинтезирующей бактерии, а также вирус мо-заики цветной капусты и группа фитопатогенных агробактерий.
Цель работы – секвенирование ВАС-клонов геномной библиотеки, принад-лежащих 12 хромосоме картофеля, а также клональной библиотеки археи; изучение биоразнообразия 35S промоторов ВМЦК и разработка молекуляр-ного маркера для идентификации агробактерий группы Agrobacterium tume-faciens..
Для выполнения работы использовались следующие методы –ультразвуковая деградация ДНК, фракционирование деградированной ДНК при помощи электрофореза в геле агарозы, клонирование, выделение ДНК ВАС-клонов, секвенирование по Сэнгеру, первичный BLAST-анализ, ПЦР, SCAR-маркирование.
В результате исследования в ходе выполнения третьего этапа работ по ГК при помощи автоматических капиллярных секвенаторов проведено сек-венирование 38324 клонов субклональной бибиотеки геномной ДНК гапло-идного картофеля линии RH. Общий объем секвенирования составил 34 мил-лиона 767 тысяч нуклеотидов. При этом проведено субклонирование 28 ВАС-клонов геномной библиотеки (суммарная длина ВАС-клонов составляет более 4 миллионов 200 тысяч нуклеотидов, при средней длине каждого ВАС-клона 150 тысяч нуклеотидов).
В рамках выполнения работ для сторонних организаций проведено секве-нирование более 4000 образцов ДНК общим объемом более 3 миллионов 200 тысяч нуклеотидов.
При помощи автоматического пиросеквенатора нового поколения 454 FLX проведено секвенирование более 120 миллионов нуклеотидов для ге-номной ДНК экстремофильной археи и фототрофной бактерии.
Таким образом, общий объем секвенирования составил за отчетный пери-од более 150 миллионов нуклеотидов.
2. Области и масштабы использования полученных результатов
Вся информации о любой живой системе, начиная с мельчайших виру-сов и бактерий и заканчивая высшими организмами, растениями и животны-ми, закодирована в генетическом материале этой системы. Поэтому ком-плексный подход к изучению функционирования геномов живых организмов должен включать все стадии исследования фунционирования генетической информации Базовым методом здесь, безусловно, является секвенирование ДНК. В настоящее время этот метод применяется не только для молекуляр-ной биологии и генетики, но и для вирусологии, микробиологии, зоологии, ботаники, эмбриологии, иммунологии и других фундаментальных биологи-ческих дисциплин. В медицине и прикладных медико-биологических иссле-дованиях анализ ДНК стал важным и необходимым методом ранней диагно-стики и мониторинга лечения рака, инфекционных и наследственных болез-ней человека. Решение многих задач связанных с биобезопасностью, в том числе и трансгенных организмов, геномной идентификацией и паспортизаци-ей личности невозможно без секвенирования ДНК. Секвенирование ДНК - обязательный компонент подавляющего большинства биотехнологий.
Процесс расшифровки геномов млекопитающих, растений и микроор-ганизмов активно развивается, и к настоящему моменту прочитано уже более двух сотен геномов различных организмов. Однако становится ясно, что только одного знания всех букв генетического кода, определение комплекса генов, необходимых для жизнедеятельности организма, недостаточно, к при-меру, для своевременной диагностики большинства заболеваний и подбора новых эффективных и высокоизбирательных лекарственных препара-тов.Процесс поточного секвенирования на современном высокопроизводи-тельном научном оборудовании выявил необходимость создания принципи-ально новой технологической схемы организации производства, начиная с этапа подготовки первичного генетического материала и заканчивая этапом компьютерной обработки полученных данных.
Молекулярно-биологические технологии являются одним из наиболее перспективных и успешно развивающихся направлений мировой и отечест-венной науки. Эти технологии представляют собою обширную и очень раз-нообразную группу методов предназначенных для исследования и анализа генома организмов (от бактерии до человека), выявления и идентификации вариаций в структуре исследуемого участка нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) вплоть до расшифровки и установления первичной последовательности его оснований. Основой молекулярно-биологических методов диагностики являются различной степени сложности технологические манипуляции с нук-леиновыми кислотами, предварительно экстрагированными из клеток и тка-ней организма. Однако современное развитие науки и практического здраво-охранения невозможно без создания новых технологий, позволяющих прово-дить анализ множества генетических изменений одновременно. Кроме того, не менее важное значение имеет совершенствование и упрощение методов анализа биологического материала, что выражается в создании целого ряда диагностических наборов, основанных на современных технологиях и на-правленных на упрощение работы по диагностике заболеваний без потери качества и точности полученного результата.