Регистрация / Вход
Прислать материал

«Исследование влияния экзогенной дву цепочечной ДНК человека
на активацию и формирование противоракового адаптивного
иммунитета и разработка принципиально новых подходов в
использовании препарата нового поколения Панаген»

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен

Информация отсутствует

Соисполнители

Организация
ИЦиГ СО РАН

Этапы проекта

1
15.06.2009 - 30.09.2009
АННОТАЦИЯ РАБОТ,
ВЫПОЛНЕННЫХ НА ЭТАПЕ № 1
«Разработка схем выделения и культивирования дендритных клеток»
государственного контракта с Федеральным агентством по науке
и инновациям от 15 июня 2009 г. № 02.740.11.0091.


Шифр: «2009-1.1-203-020»
Период выполнения этапа 15 июня 2009 г. – 30 сентября 2009 г.
Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный университет» (НГУ)
630090, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2
Цель работы Разработка схем выделения и культивирования дендритных клеток

1. Наименование разрабатываемой продукции
Схемы выделения и культивирования дендритных клеток мыши и человека.
2. Характеристика выполненных на этапе работ по созданию продукции
2.1. В ходе работ первого этапа были отработаны два протокола генерации дендритных клеток мышей и человека. Для мышиных дендритных клеток был апробирован стандартный протокол с использованием ИЛ-4, для дендритных клеток человека – протокол генерации с использованием ИНФα. Наиболее важным в используемых процедурах было получение зрелых, способных к быстрой масштабной активации популяции дендритных клеток.
Для генерации дендритных клеток мышей использовали животных линии CBA, у которых выделялись клетки костного мозга, из которых формировалась популяции зрелых дендритных клеток. Проведена предварительная оценка активации созревания по поверхностным маркерам CD34, CD80, CD86 дендритных клеток с использованием препарата геномной ДНК человека в качестве дозревающего стимула. Таким образом, сгенерированная популяция дендритных клеток обладает высоким потенциалом антигенпрезентирующих клеток.
Для оценки качества сгенерированных дендритных клеток человека (способности проявлять специфическую активность) была протестирована их способность индуцировать пролиферативный ответ у мононуклеаров-респондеров. В качестве дозревающего стимула были протестированы стандартный индуктор липополисахарид из стенки бактерий и препарат Панаген. Как демонстрируют результаты серии экспериментов, препарат Панаген обладает выраженным индуцирующим эффектом на развитие у сгенерированных дендритных клеток аллостимуляторной активности. Эти факты свидетельствуют о том, что используемый протокол позволяет получить популяцию зрелых, подготовленных для активации дендритных клеток.
Выполненные работы полностью соответствует требованиям задания.
2.2. Важнейшим отличием применения препарата «Панаген» как активатора противоракового адаптивного иммунитета от аналогов, разрабатываемых в мире, является человеческое, а не синтетическое происхождение активной субстанции препарата. Этот фактор позволяет избежать абсолютно неизученных последствий использования чужеродного генетического материала на организм человека. Физиологическое происхождение активной субстанции препарата позволяет при назначаемых терапиях не выходить за рамки естественных физиологических пределов, что обеспечивает более высокую безопасность и высокую специфичность препарата в активации противоракового адаптивного иммунитета.
Кроме того, отработанная процедура генерации дендритных клеток человека согласно интерфероновому протоколу позволяет получать высоко активные дендритные клетки.
2.3. Чрезвычайно важным для проведения всех последующих исследований по проекту является чистое выделение дендритных клеток мыши и человека и их культивирование в подходящих условиях.
На отчетном этапе работы отработана схема выделения и культивирования мышиных ДК для последующей их инъекции животным и проведения других экспериментов, связанных с целями нашей работы.
В последнее время было показано, что частично зрелые ДК человека могут быстро генерироваться при культивировании моноцитов с ГМ-КСФ и ИФН-a, и такой путь генерации представляется более физиологичным. Полученные ДК имеют ряд преимуществ – генерируются быстрее по времени, характеризуются высокой способностью к захвату антигена, сохраняют стабильность в отсутствие цитокинов, имеют более высокую миграционную активность и эффективно стимулируют ответ иммунных клеток. Именно такой протокол был нами выбран и экспериментально отработан. Дендритные клетки, сгенерированные согласно примененному протоколу, легко и эффективно стимулируются экзогенной ДНК и могут быть использованы для производства высоко специфичных индивидуальных вакцин.
3. Области и масштабы использования полученных результатов
3.1. Область применения полученных результатов – медицина, здравоохранение.
Дендритные клетки, генерированные с помощью подобранных методик, будут использоваться в дальнейших работах по изучению активации адаптивного противоракового иммунитета и в производстве высоко активных индивидуальных вакцин. Основными потребителями продукта, полученного в результате реализации проекта, будут онкологические центры и клиники.
Результаты, представляющие научный интерес, будут также внедрены в образовательный процесс на факультете естественных наук Новосибирского государственного университета.
3.2. Ход практического внедрения полученных результатов.
В настоящее время написан и находится в состоянии согласования реферат по итогам проведенных работ, который будет внедрен в образовательный процесс на Факультете естественных наук Новосибирского государственного университета в курс иммунологии как один из разделов биологии антигенпрезентирующих клеток. Методы, которые используются для выполнения поставленных задач, будут адаптированы для проведения практических занятий со студентами старших курсов. Это методы клеточной биологии: культивирование клеток in vitro и криоконсервация, выделение незрелых дендритных клеток и методики для индукции их созревания, методы пульсации дендритных клеток антигенами опухоли (трансфекция, инкубация с гомогенатами опухолевых клеток).
3.3. Оценка или прогноз влияния полученных результатов, товаров и услуг, созданных на основе полученных результатов, на подготовку и закрепление в сфере науки и образования научных и научно-педагогических кадров, достижение или превышение заданных индикаторов и показателей.
Утверждены темы кандидатских диссертаций двум аспирантам. Пять новых сотрудников были приняты на работу в Новосибирский государственный университет, из них четыре человека – молодые исследователи.
В целом значения программных индикаторов и показателей практически полностью соответствуют техническому заданию, несмотря на то, 2009 год еще не завершился.
4. Выводы
В ходе выполнения работ по 1 этапу были сделаны важнейшие первые шаги для исследования влияния экзогенной двуцепочечной ДНК человека на активацию и формирование противоракового адаптивного иммунитета, а именно выбраны протоколы и отработаны все методики, связанные с выделением и культивированием дендритных клеток мыши и человека.
Руководитель работ ________________ С.Н. Загребельный
проф., д.б.н. подпись
___ __________ 2009 г.
М.П.
Развернуть
2
01.10.2009 - 15.12.2009
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ВЫПОЛНЕННЫХ РАБОТ
Целью работы по контракту является исследование влияния экзогенной двуцепочечной ДНК человека на активацию и формирование противовопухолевого адаптивного иммунитета принципиально новых подходов в использовании препарата нового поколения «Панаген».
Противоопухолевый иммунитет относится к системе клеточного иммунитета и связан с активацией этой системы в ответ на появление опухолевых антигенов. Одним из звеньев этой системы являются дендритные клетки, которые представляют соответствующие раковые антигены Т-клеткам и индуцируют противораковый иммунный ответ на эти антигены. Патологические процессы и в особенности развитие малигнизированной ткани приводят к подавлению антигенпрезентирующей и аллостимулляторной активности дендритных клеток и тем самым снижают как общий уровень иммунной защиты организма, так и специфический противораковый иммунитет.
Таким образом, для активации иммунной защиты необходимо повысить уровень компетентности дендритных клеток в организме и направить их активность на опознавание и презентацию специфических опухолевых антигенов и развитие Т цитотоксического противоракового иммунного ответа.
На первом этапе работы по проекту были проведены эксперименты, позволившие найти пути повышения эффективности генерации дендритных клеток, разработать методы их выделения и культивирования.
Второй этап работы посвящен разработке методов активации созревания дендритных клеток и исследованию препарата экзогенной ДНК «Панаген» в качестве стимула созревания дендритных клеток. Признаком «зрелости» дендритных клеток является наличие на их поверхности соответствующих молекул, регистрируемых с помощью специфических антител.
В ходе экспериментов была исследована способность дендритных клеток поглощать экзогенную ДНК, а также локализация поглощенной ДНК во внутриклеточных компартментах.
Было обнаружено, что экзогенная ДНК способна проникать в дендритные клетки и при этом оказывается в ядре, преимущественно во внехромосомном пространстве. При этом обнаружено, что такое распределение захваченной ДНК во внутриклеточном пространстве характерно именно для дендритных клеток, что указывает на наличие специфических рецепторов для ДНК на их поверхности. Важной особенностью исследуемой системы является также отсутствие конкатемеризации ДНК, в отличие от наблюдаемого с другими типами клеток.
Традиционным стимулятором созревания дендритных клеток является бактериальный липополисахарид (ЛПС). Однако при использовании экзогенной ДНК в качестве стимулятора дозревания обнаружено, что некоторые типы ДК, не отвечающие на стимуляцию ЛПС, активируются ДНК.
Помимо активации созревания ДК в культуре (ex vivo) были проведены эксперименты на организме лабораторных животных – мышей (in vivo) введением экзогенной ДНК в сочетании с цитостатиком циклофосфаном. Эффект стимуляции созревания ДК был подтвержден на уровне организма, и установлены временные рамки наиболее эффективного режима использования сочетанного воздействия цитостатика и экзогенной ДНК.
Полученные данные позволяют использовать препарат экзогенной ДНК (Панаген) в качестве эффективного стимулятора дозревания дендритных клеток при получении высокоиммуногенных индивидуальных вакцин на основе ДК.
Результаты исследований использованы в качестве дополнительных глав в учебном процессе на Факультете естественных наук и Медицинском факультете в курсах иммунологии.
Развернуть
3
01.01.2010 - 30.06.2010
3.1. Генерация популяции
высокоэффективных дендритных
клеток, пульсированных раковым
антигеном.
3.2. Проверка действия
индивидуальных противораковых
вакцин на модели мышь.
3.3. Определение индекса
цитотоксичности человеческих Т
лимфоцитов по отношению к
опухолевым клеткам, антигены которых
использовались для получения
индивидуальной вакцины.
Развернуть
4
01.07.2010 - 15.12.2010
4.1 . Характеристика различных схем
применения сочетания цитостатика и
препарата экзогенной ДНК, в т.ч.:
4.1.1. Разработка схем применения
сочетания цитостатика и препарата
экзогенной ДНК.
4.1.2. Постановка экспериментальных
процедур по введению цитостатика и
препарата экзогенной ДНК согласно
разработанным схемам.
4.2. Выявление основных временных
параметров введения цитостатика и
препарата ДНК, критичных для
формирования противоракового
адаптивного иммунитета
4.3. Проведение технико-
экономической оценки полученных
результатов
Развернуть
5
01.01.2011 - 30.06.2011
5.1. Разработка рекомендаций для
использования в клинической практике
разработанной схемы введения
циклофосфана и экзогенной ДНК, а
также программы внедрения НИР в
образовательный процесс
5.2. Адаптация найденных параметров
совместного введения цитостатиков и
препарата «Панаген» к использованию
на человеке в ходе фазы II, III
клинических испытаний препарата в
качестве дополнительных мероприятий
к основному заявленному,
направленному на характеристику
лейкостимулирующего действия.
5.3. Экспериментальная проверка на
мышах изменений в скорости роста
опухолей при применении
разработанной схемы введения
цитостатика и препарата «Панаген», в
т.ч.:
5.3.1. Теоретическое обоснование и
разработка принципиальных схем
противоопухолевого воздействия
сочетания препаратов доксорубицин-
циклофосфан-«Панаген».
5.3.2. Экспериментальная проверка на
мышах изменений в скорости роста
опухолей при применении
разработанной схемы введения
цитостатика и препарата «Панаген».
Развернуть
6
01.07.2011 - 31.08.2011
6.1. Разработка дополнительного
протокола клинических испытаний с
использованием полученных данных
проверенных экспериментальных схем.
6.2. Подготовка и осуществление
процедуры по указанному протоколу в
ходе фазы II, III клинических
испытаний препарата «Панаген»
препарата в качестве дополнительных
мероприятий к основному заявленному.
6.3. Адаптация найденных параметров
совместного введения цитостатиков и
препарата «Панаген» к использованию
на человеке в ходе фазы II, III
клинических испытаний препарата в
качестве дополнительных мероприятии
к основному заявленному,
направленному на характеристику
лейкостимулирующего действия.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров
Тема
Изучение процессов активации поверхности сверхвысокомолекулярных полиолефинов различными методами с целью создания на их основе композиционных наноматериалов нового поколения.
Продолжительность работ
2013, 7 мес.
Бюджетные средства
20 млн
Количество заявок
12
Тема
Исследование влияния низкомолекулярных соединений на регуляцию метаболизма человека.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
18 млн
Количество заявок
10
Тема
Доклинические исследования противовирусного препарата пептидной природы, подавляющего репликацию вирусов гриппа человека А (H1N1)
Продолжительность работ
2016 - 2018, 26 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
0
Тема
Доклинические исследования противовирусного препарата пептидной природы, подавляющего репликацию вирусов гриппа человека А (H1N1)
Продолжительность работ
2016 - 2018, 24 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2
Тема
Исследование влияния соединений микробного происхождения на обмен веществ у человека в норме и при патологии.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 15 мес.
Бюджетные средства
24 млн
Количество заявок
3