Регистрация / Вход
Прислать материал

Моделирование нарушений генной экспрессии, приводящих к нестабильности генома, подавлению функций стволовых клеток и хромосомным болезням

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.0288
Организация
ИМГ РАН
Руководитель работ
Гвоздев Владимир Алексеевич
Продолжительность работ
2009 - 2011, 25 мес.
Бюджетные средства
10,5 млн
Внебюджетные средства
2,1 млн

Информация отсутствует

Участники проекта

Зам. руководителя работ
Шевелев Юрий Ясенович

Этапы проекта

1
07.07.2009 - 15.12.2009
1.1. Анализ уровня транскрипции мобильных элементов у
дрозофилы в норме и на фоне мутаций по генам таеЫгот,
1иЛог и Ъе1, имеющих ортологов в геноме человека.
1.2. Анализ степени обогащенности хроматина мобильных
элементов активными и репрессорными модификациями
гистонов на фоне мутаций по генам РНКи.
1.3. Поиск в хромосоме 3 дрозофилы нового гена системы
РНКи, мутация в котором вызвана внедрением Р-элемента.
1.4. Обеспечение поставок антител и реактивов для
молекулярной биологии.
1.5. Обслуживание парка микроскопного оборудования.
Развернуть
2
01.01.2010 - 30.06.2010
Данная работа посвящена исследованию на модельном объекте, дрозофиле, фундаментальных закономерностей процесса РНК-интерференции (РНКи), как одного из важнейших компонентов системы регуляции экспрессии генов и, в особенности, мобильных элементов. Мобильные элементы – это последовательности ДНК, способные перемещаться по геному, вызывая мутации генов и хромосомные перестройки. Особенно опасен этот процесс в клетках зародышевого пути, так как может привести к стерильности особи или к появлению у потомства наследственных дефектов. Поэтому в организме существуют системы, ограничивающие экспрессию и перемещение мобильных элементов. Основную роль в подавлении экспрессии мобильных генетических элементов в репродуктивных органах животных играет РНК-интерференция, а ключевыми действующими агентами этой системы являются белки подсемейства PIWI. Нарушение белков подсемейства PIWI приводит как к значительному недоразвитию гонад, так и к резкой активации мобильных элементов в сохраняющихся зачатках этих органов.

На отчетном этапе удалось детально исследовать роль белка PIWI в подавлении экспрессии мобильных элементов благодаря использованию новой мутации в гене piwi, которая не приводит к катастрофическому нарушению морфологии яичников дрозофилы и позволяет соотнести экспрессию того или иного мобильного элемента с определенными герминальными или соматическими клетками. Исследование молекулярной природы этой мутации показало, что она приводит к синтезу укороченного транскрипта, способного к трансляции с образованием белка, лишенного N-конца. Синтезируемый дефектный белок не входит в ядро, как нормальный PIWI, и становится цитоплазматическим, образуя вокруг ядра кольцо. На фоне данной мутации наблюдается значительная дерепрессия мобильных элементов. Таким образом впервые было продемонстрировано, что именно ядерная функция белка PIWI связана с подавлением мобильных элементов.
  
Это заключение хорошо согласуется с обнаружением измененной структуры хроматина мобильных элементов на фоне исследованной мутации. Наблюдалось увеличение количества тех модификаций гистонов, которые определяют существование «открытого», активно транскрибируемого хроматина.
Использование уникальной мутации в гене piwi позволило показать, что нарушение функции РIWI как репрессора мобильных элементов не снимает другой функции этого белка, связанной с поддержанием стволовых клеток, обеспечивающих нормальное развитие репродуктивных органов.

Благодаря применению адекватной генетической системы удалось установить участие белка TUDOR, взаимодействующего с белками подсемейства PIWI, в подавлении экспрессии мобильных элементов. Белки PIWI и TUDOR, экспрессирующиеся в зародышевой ткани, являются эволюционно консервативными. Поэтому, полученные результаты особенно важны в свете того, что нарушение генетической программы поддержания герминальных клеток в недифференцированном состоянии у млекопитающих может приводить к стерилности, образованию тератом и других герминальных опухолей.

Для проведения экспериментальных работ по проекту требовались реактивы для молекулярной биологии (антитела), которые были поставлены за счет собственных средств ООО НПО «БиоТест Системы». Данная фирма поставила шесть антител, которые были применены в экспериментах по хроматиниммунопреципитации и в экспериментах по иммуноокрашиванию яичников дрозофилы.

Проведение экспериментальных работ по проекту было обеспечено парком оборудования для микроскопии, поддержание которого в работоспособном состоянии было осуществлено на безвозмездной основе ООО «Миксис», являющегося официальным представителем фирмы Leica в России. За отчетный период данная фирма провела техническое обслуживание и наладку флуоресцентного микроскопа Leica DM6000.
Развернуть
3
01.07.2010 - 15.12.2010
Разработан метод, позволяющий одновременно следить за транскрипционной активностью локуса, его пространственным положением в ядре и белками, специфичными для тех или иных ядерных компартментов. Метод основан на применении тирамидной амплификации сигнала гибридизации с РНК-зондом, приводящей к флуоресцентному мечению белков, находящихся вблизи от РНК-РНК гибрида, с последующей визуализацией хромосомных районов гибридизацией с флуоресцентно-мечеными ДНК-зондами и иммуноокрашиванием белков.
Роль архитектуры ядра в регуляции экспрессии генов была исследована на полученной в лаборатории уникальной модельной системе, в которой на фоне эу-гетерохроматиновой инверсии наблюдалось подавление активности репортерных генов, находящихся в гомологичном районе неперестроенной хромосомы (т.н. транс-инактивация). Проведенные исследования позволили установить механизм транс-инактивации, который заключается в «слипании» фрагмента гетерохроматина, перенесенного в результате инверсии в эухроматин, с прицентромерным гетерохроматином (с образованием хромосомной петли между ними). Гомологичный район хромосомы без инверсии в результате частичного спаривания с инвертированным участком также «затягивается» в гетерохроматиновый компартмент ядра, обогащенный гетерохроматиновым белком HP1, что и приводит к транс-инактивации некоторых из встроенных в него репортерных генов.
Исследовано влияние механизма РНК-интерференции на структуру хроматина теломерных районов хромосом дрозофилы. Иммуноокрашивание и хроматиниммунопреципитация яичников дрозофилы показали зависимость состава теломерного гетерохроматина (расположенного в нем белка HP1 и «активных» модификаций гистонов) от системы подавления мобильных элементов РНК-интерференцией (piРНК-путь). В согласии с этим находится результат, показывающий транскрипционную активацию теломерных ретротранспозонов при искусственном снижении в яичниках дрозофилы количества ключевого белка piPHК пути – Piwi. Полученные результаты указывают на роль РНК-интерференции (piPHК пути) в поддержании стабильности и целостности теломер в герминальных клетках дрозофилы. Эти данные проливает свет на способ функционирования подобных белков у млекопитающих, где они участвуют в подавлении ретротранспозонов в семенниках, обеспечивая стабильность наследуемого генома.
Развернуть
4
01.01.2011 - 31.08.2011
Исследована роль гистондеацетилаз в репрессии генных локусов, находящихся вблизи от ядерной ламины. Проведена оценка методом РНК- и ДНК-флуоресцентной in situ гибридизации внутриядерной локализации генных локусов, переходящих из молчащего, репрессированного ламиной состояния к активной экспрессии в ходе развития дрозофилы. Разработана программа внедрения результатов НИР в образовательный процесс.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров
Продолжительность работ
2012 - 2013, 12 мес.
Бюджетные средства
2,73 млн
Организация
ФГБОУ ВО "ВГУ"
профинансировано
Тема
Использование стволовых клеток костного мозга для поддержания функции сердца и поджелудочной железы
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Количество заявок
4
Тема
Разработка способа восстановления мужской репродуктивной функции с помощью аутологичных и аллогенных культур стволовых и прогениторных клеток.
Продолжительность работ
2009 - 2010, 17 мес.
Бюджетные средства
7 млн
Количество заявок
3
Тема
Разработка метода подавления ангиогенеза путем экспрессии на поверхности клеток навигационного рецептора Т-кадгерина и других поверхностных рецепторов, блокирующих прорастание сосудов в опухоли.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка пролонгированных ингибиторов для подавления экспрессии генов, ответственных за возникновение лейкозов и лимфом.
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
15 млн
Количество заявок
2
Тема
Получение композиций, содержащих секретируемые компоненты стволовых клеток.
Продолжительность работ
2014 - 2016, 28 мес.
Бюджетные средства
48 млн
Количество заявок
1