Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка фундаментальных основ и экспериментальных подходов для исследования ключевых регуляторных ферментов на молекулярном и клеточном уровне

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.0291
Организация
МБЦ МГУ
Руководитель работ
Вржещ Петр Владимирович
Продолжительность работ
2009 - 2011, 26 мес.
Бюджетные средства
12 млн
Внебюджетные средства
2,4 млн

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
07.07.2009 - 31.08.2009
Анализ научно-технической литературы по основным направлениям исследования.
Разработка теоретических подходов для получения сенсоров на основе индуктивно-резонансного переноса энергиижелатиназкаспаз (ИРПЭ-сенсоры) (металлопротеиназ на основе для 2,9), и цветных флуоресцирующих белков. Анализ особенностей строения циклооксигеназного и пероксидазного активных центров фермента простагландин-Н-синтазы.
Молекулярное моделирование структур высокоспецифичных субстратов и поиск экзосайтов их связывания. Расчет оптимального нуклеотидного состава сайта расщепления, включенного в линкер между флуоресцирующими белками.
Разработка экспериментальных методик(выделения флуоресцирующих белксжг -исследование их флуореецентных характеристик и процесса агрегации).
Разработка экспериментальных методик (получения и поддержания заданных концентрации (от 5 до 1200 мкМ) растворенного в реакционной среде молекулярного кислорода, получения интегральных кинетических кривых с использованием электрода Кларка в области высоких концентраций растворенного кислорода)
Развернуть
2
01.09.2009 - 15.12.2009
Проведено клонирование фрагмента ДНК, кодирующего флуоресцентный белок в челночном векторе. Получена рекомбинантная плазмида, содержащей слитые гены красных флуоресцирующих белков TagRFP и KFP. Включена линкерная последовательность, содержащая сайт узнавания каспазы и желатиназ, в плазмиду между генами флуоресцирующих белков. Осуществлено субклонирование фрагмента ДНК, содержащего белок слияния, в прокариотическом трансляционном векторе. Создан прокариотический вектор, несущий ген TagRFP-23-KFP. Разработана методика получения генно-инженерной конструкции сенсоров.
Проведена оптимизация физико-химических условий протекания ферментативной реакции катализируемой ферментом простагландин-Н-синтазой.
Определены концентрационные зависимости скоростей реакции, предельного выхода продукта и константы скорости инактивации фермента в процессе реакции для циклооксигеназной, пероксидазной и суммарной реакций простагландин-Н-синтазы. Показано, что на количественные параметры циклооксигеназной реакции (максимальная скорость, Km , предельный выход продукта и др.) влияет донор электронов, являющийся субстратом для пероксидазной реакции.
Разработана методика расчета параметров инактивации фермента с учетом снижения скорости реакции за счет конверсии субстрата в ходе ферментативной реакции.
Построена кинетическаяо модель действия фермента простагландин-Н-синтазы. Установлено, что кинетические свойства бифункционального фермента ПС описываются двумерной кинетической схемой с учетом реальных свойств фермента.
Разработана схема выделения и очистки фермента ПС из природного источника. Чистота очищенного препарата составляет более 95%.
Развернуть
3
01.01.2010 - 30.06.2010
Проведена экспрессия белка слияния со вставкой для узнавания каспазы и желатиназ в прокариотическом трансляционном векторе. Показана эффективная экспрессия слитых белков в клетках E. coli. Выделенные рекомбинантные белки очищены и охарактеризованы с помощью различных физико-химических методов. Изучены флуоресцентные свойства сенсоров и оценена эффективность переноса энергии в полученных конструкциях.
Подобраны оптимальные концентрации синтетических субстратов и ферментов для наблюдения за кинетикой расщепления. Изучены кинетические свойства каспазы и желатиназ на стандартном флуорогенном субстрате. Определены рабочие концентрации сенсоров и ферментов.
Определено эффективное расщепление конструкции методом флуоресцентной спектроскопии. Эффективность расщепление полученного сенсора под действием каспазы-3 доказана как с помощью флуоресцентной спектроскопии, так и методом электрофореза и иммуноблоттинга.
Проведено исследование фермента простагландин-Н-синтазы методами молекулярного моделирования для выявления аминокислотных остатков, ответственных за инактивацию фермента в процессе реакции. Проведенное математическое моделирование ПС позволило предположить, что в осуществлении ферментативной реакции ПС-1 участвует 2 протона, а Tyr504 является резервуаром для хранения запасного протона. В случае диссипации протона (в виде H3O+) в пероксидазном сайте, альтернативный протон для дальнейшего осуществления пероксидазной реакции отщепляется от Tyr504, который забирает единственный протон с Tyr385 в циклооксигеназном сайте, вследствие чего и происходит циклооксигеназная инактивация, но пероксидазная активность при этом сохраняется. При отсутствии пероксидазной активности, исходя из этой схемы, невозможно и осуществление циклооксигеназной реакции. Полученные данные позволили предположить, что пероксидазная инактивация фермента происходит в связи с одновременной диссипацией протона водорода в водное окружение гема и отсутствием альтернативного источника протона водорода на Tyr504.
На основании молекулярного моделирования была выдвинута гипотеза о механизме инактивации ПС-1, состоящая во взаимодействии одной из резонансных форм тирозил радикала с молекулой воды с образованием неактивной производной формы тирозина.
Разработана методика пробоподготовки препарата фермента простагландин-Н-синтазы для масс-спектрометрических исследований. Разработана методика осуществления полной инактивации фермента простагландин-Н-синтазы при проведении реакции в малом объеме для масс-спектрометрических исследований. Получены и проанализированы масс-спектры белка и гидролизата белка для фермента простагландин-Н-синтазы до инактивации, после инактивации в ходе циклооксигеназной реакции и пероксидазной реакций по отдельности и при их одновременном протекании, а также при прединкубации фермента с перекисными субстратами пероксидазной реакции. Проведена расшифровка с использованием данных масс-спектрометрических исследований и молекулярного моделирования природы химических реакций, приводящих к инактивации. Масс-спектрометрические данные не подтверждили выдвинутую гипотезу, так как полипептид, содержащий Tyr385 относится к третьей группе, то есть присутствует в масс-листе во всех образцах. Тем не менее, в препарате фермента ПС всегда присутствует незначительное количество белка потерявшего активность вследствии тепловой инактивации, не связанной с инактивацией в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Поэтому требуется дополнительное исследование природы ионов, представленных в масс-листе, но не совпадающих по массе с полипептидами, которые должны образовываться в ходе трипсинолиза. Количество подобных ионов существенно возрастает для инактивированного в ходе реакций фермента ПС, по сравнению с нативным белком, что может быть косвенным свидетельством химических модификаций в процессе инактивации. В масс-спектре фермента ПС, обработанного трипсином, не подвергнутого инактивации и фермента инактивировавшегося в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций присутствует ион полипептида, содержащего каталлитически важный аминокислотный остаток Tyr385.
Развернуть
4
01.07.2010 - 15.12.2010
Тестирование сенсора в среде
GROMACS и его оптимизация.
Построение и анализ структур
промежуточных соединений
арахидоновой кислоты, образующихся
в ходе ферментативной реакции,
методами квантовой химии. Изучение
механизмов проникновения
арахидоновой кислоты и кислорода в
циклооксигеназный активный центр
методами молекулярного
моделирования.
Тестирование сенсора в среде
GROMACS: ОКОМ АС 8: проверка результатов на
флуоресцентнм ридере в различных
условиях
Развернуть
5
01.01.2011 - 30.06.2011
Получение матриксных моделей для
исследования свойств конструкции
сенсора т у!1го методами
флуоресцентной время-разрешенной
конфокаль-ной микроскопии в режиме
реального времени. Опти-мизация
условий тестиро-вания сенсоров на
матри-ксном уровне. Определение
активности сенсоров по уровню
изменения флу-оресценции. Разработка
двухмерной кинетической модели
бифункциональных ферментативных
реакций для исследования свойств би-
функциональных ферментов.
Определение влияния пероксидазной
активности простагландин-Н-синтазы
на параметры циклооксигеназной
активности простагландин-Н-синтазы.
Разработка программы внедрения
результатов НИР в образовательный
процесс.
Получение матриксных моделей для
исследования свойств конструкции т
УЙГО методами флуоресцентной
времяразрешенной конфокальной
микроскопии в режиме реального
времени.
Развернуть
6
01.07.2011 - 01.09.2011
Поиск соединений структурно близких
к арахидоновой кислоте
(оксипроизводные арахидоновой
кислоты и др), потенциально
способных принимать участие в
ферментативной реакции,
катализируемой ферментом
простагландин-Н-синтазой в качестве
субстратов. Экспериментальная
проверка реакционной способности
соединений, выбранных в качестве
искусственных субстратов фермента
простагл андин-Н-синтазы. Тестирова-
ние разработанных сенсоров по
изменению времени жизни
флуоресценции и флуоресценции на
матриксных моделях в
оптимизированных условиях.
Разработка программы лекционного
курса «Кинетика ферментативных
реакций, сопровождающихся
инактивацией фермента в ходе
катализируемой реакции» и
практических занятий по курсу.
Разработка научно-методических
материалов к лекционному курсу
«Кинетика ферментативных реакций,
сопровождающихся инактивацией
фермента в ходе катализируемой
реакции» и практическим занятиям по
курсу. Проведение патентных
исследований по теме «Генетически
кодируемые сенсоры на основе
цветных флуоресцирующих белков и
индуктивно-резонансного переноса
энергии для определения активности
желатиназ (металлопротеиназ) с глубиной поиска 10-15 лет по базам www.fips.ru, www.wipo.int и wwwespacenet.com в областях поиска: поиск фирм, занятых в данной области,
исследование рынка продукции и
ситуации, патентная ситуация
Написание заключительного отчета
НИР.
Определение активности
разработанных сенсоров по изменению
времени жизни флуоресценции.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров
Продолжительность работ
2005 - 2006, 19 мес.
Бюджетные средства
10 млн
профинансировано
Продолжительность работ
2012 - 2013, 12 мес.
Бюджетные средства
2,62 млн
Организация
ИМГ РАН
профинансировано
Тема
Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
10 млн
Количество заявок
5
Тема
«Организационно-техническое обеспечение проведения международной молодежной конференции «Генетика животных и растений - фундаментальные проблемы и современные экспериментальные подходы»».
Продолжительность работ
2012, 6 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
1
Тема
Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук по следующим областям: - общая биология и генетика; - физико-химическая молекулярная и клеточная биология; - фундаментальная медицина и физиология
Продолжительность работ
2010 - 2012, 26 мес.
Бюджетные средства
0 млн
Количество заявок
32
Тема
Проведение научных исследований молодыми кандидатами наук в следующих областях: - общая биология и генетика; - физико-химическая молекулярная и клеточная биология; - фундаментальная медицина и физиология
Продолжительность работ
2011 - 2013, 29 мес.
Бюджетные средства
0 млн
Количество заявок
67
Тема
Проведение научных исследований целевыми аспирантами по следующим областям: - общая биология и генетика; - физико-химическая молекулярная и клеточная биология; - фундаментальная медицина и физиология
Продолжительность работ
2010 - 2011, 14 мес.
Бюджетные средства
0 млн
Количество заявок
27