Регистрация / Вход
Прислать материал

«Исследование фундаментальных механизмов патогенеза нейродегенеративных заболеваний и разработка современных технологий для их лечения»

Стадии проекта
Предложение принято
Конкурс завершен
Проект закончен
Проект
02.740.11.0302
Продолжительность работ
2009 - 2011, 26 мес.
Бюджетные средства
12 млн
Внебюджетные средства
2,4 млн

Информация отсутствует

Этапы проекта

1
07.07.2009 - 15.11.2009
1. Проводилось исследование глутаматергических синапсов миндалевидного тела (амигдалы) – участка мозга, отвечающего за эмоциональную память, значительно вовлеченного в патологический процесс при болезни Альцгеймера. Мы показали, что бета-амилоидный пептид значительно нарушает глутаматергическую синаптическую передачу в миндалине, что проявляется в потенциации базальной нейротрансмиссии, возрастании зависимости амплитуды возбуждающего постсинаптического тока от силы стимула, снижении возбудимости нейрона и блокировании долговременной потенциации. Обнаруженные нами эффекты бета-амилоидного пептида могут лежать в основе нарушений памяти и обучения при болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний.
2. Эксперименты по изучению функции периферических синапсов проводились на изолированных диафрагмальных мышцах мыши. Установлено, что бета-амилоидный пептид оказывает выраженное влияние на функцию периферического холинергического синапса. Эффект бета-амилоидного пептида заключается, во-первых, в снижении амплитуды потенциала концевой пластинки при редкой стимуляции за счет постсинаптических механизмов, а во вторых, в усилении депрессии потенциала концевой пластинки в процессе высокочастотной активности, что может быть обусловлено пресинаптическим механизмом - изменением соотношения между вкладом различных пулов синаптических везикул нервного окончания в функцию синапса. Таким образом, влияние бета-амилоидного пептида на функцию нервно-мышечного синапса может вносить вклад в патогенез болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний, в частности, в развитие двигательных нарушений.
3. Для оценки процессов экзо-эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул использовали флуоресцентный краситель FM 1-43 (фирма Biotium, США) в концентрации 6 мкМ. Установлено, что секреция медиатора в присутствии амилоидного пептида осуществляется посредством полного слияния везикул с пресинаптической мембраной (полным экзоцитозом), и присутствие бета-амилоидного пептида не вызывает грубых нарушений экзо-эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул в двигательном нервном окончании мыши.
4. Проводилась внутриклеточная микроэлектродная регистрация мембранного потенциала покоя (МПП) мышечных волокон изолированных диафрагмальных мышц мыши и портняжной мышцы лягушки. Установлено, что бета-амилоидный пептид в концентрациях от 10-6 до 10-8 М обладает выраженным деполяризующим эффектом на скелетные мышечные волокна как теплокровных (мышь), так и холоднокровных (лягушка) животных. Данный эффект развивается в течение 60-220 минут, и является полностью обратимым. Миографические исследования показали, что бета-амилоидный пептид также нарушает карбахолин-вызванную сократимость скелетной мышцы лягушки, но не мыши. Данное различие в эффекте бета-амилоидного пептида на сократимость, вероятно, связано с различными величинами фактора надежности нервно-мышечной передачи в синапсах мыши и лягушки. Обнаруженные нами феномены могут быть связаны с модуляцией ионных транспортных систем мембраны мышечного волокна под действием бета-амилоидного пептида, в частности, участвующими в формировании разницы между вне- и внутриклеточной концентрациями ионов натрия.
Установленные нами эффекты бета-амилоидного пептида имеют большое функциональное значение и могут лежать в основе двигательных нарушений у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими нейродегенеративными заболеваниями.
5. При помощи ретроградного флуоресцентного маркера Fluorogold (FG) мы изучали влияние бета-амилоидного пептида на аксонный транспорт. Удобной моделью в таком исследовании служит седалищный нерв, поскольку он легко доступен для манипуляций, и обладает значительной длиной. Нами впервые были получены данные о том, что бета-амилоидный пептид обладает выраженным угнетающим эффектом на ретроградный аксонный транспорт в мотонейронах. Обнаруженный феномен, очевидно, оказывает значительный вклад в развитие болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний.
6. Проведена ПЦР амплификация и клонирование генов факторов транскрипции человека Oct4, NANOG, Sox2, Klf4, cMyc и факторов роста человека VEGF (изоформы 121, 165, 189) и FGF2. Получены экспрессионные вектора на основе плазмид pcDNA3.1 и pBudCE4.1.
7. Созданы генетические конструкции, одновременно и независимо экспрессирующие комбинации рекомбинантных белков: pBud-EGFP-cMyc, pBud-EGFP-Klf4, pBud-EGFP-Sox2, pBud-EGFP-Oct4, pBud-Sox2-Oct4, pBud-NANOG-Oct4, pBud-Klf4-Oct4, pBud-cMyc-Oct4, pBud-cMyc-Klf4, pBud-VEGF121-FGF2, pBud-VEGF165-FGF2, pBud-VEGF89-FGF2, pBud-EGFP-FGF2, pBud-VEGF121-EGFP, pBud-VEGF165-EGFP, pBud-VEGF89-EGFP. Ген зеленого флюоресцентного белка EGFP позволяет экспрессировать рекомбинантный белок-репортер, позволяющий оценивать экспрессию белка методами флюоресцентной микроскопии.
Точность сборки генетических конструкций и отсутствие мутаций подтверждено рестрикционным анализом и ДНК секвенированием.
8. Проведено выделение и культивирование клеток эктомезенхимы зачатка зуба человека (эктомезенхимальные стволовые клетки – ЭМСК) и мононуклеарных клеток пуповинной крови (МК-ПК) человека. Проведена трансфекция ЭМСК, МК-ПК и НЕК392Т полученными в ходе выполнения работы генетическими конструкциями. Эффективность трансфекции клеточных культур определяли по флюоресценции EGFP.
Состав выполненных работ соответствует требованиям задания, календарного плана и нормативной документации.
Выполненные работы удовлетворяют условиям государственного контракта, задания, календарного плана.
Содержание отчетной документации соответствует требованиям задания.
Развернуть
2
01.01.2010 - 30.06.2010
1.Было установлено, что у мышей с генетической моделью бокового амиотрофического склероза (БАС) происходят выраженные нарушения синаптической передачи. Электрофизиологически при регистрации потенциалов концевой пластинки было выявлено, что на пресимптоматической стадии у мышей с генетической моделью БАС происходит значительное снижение базового квантового выброса нейромедиатора, а также наблюдается менее выраженная депрессия ПКП в процессе высокочастотной синаптической активности.
2. В экспериментах с применением флуоресцентного маркера FM 1-43 было выявлено, что в генетической модели БАС происходит значительное снижение синапсов с нормальным протеканием процессов экзо-эндоцитоза и рециклирования синаптических везикул.
3. При использовании флуоресцентного маркера филипина были обнаружены значительные нарушения метаболизма холестерина в нервно-мышечных препаратах мышей с генетической моделью БАС В частности, содержание холестерина было снижено как в области синапса, так и мышечного волокна. Кроме того, наблюдается появление синаптических регионов аномальной величины и формы (фрагментация), что свидетельствует не только о нарушении метаболизма холестерина, но и о нарушении синаптической морфологии и физиологии в целом.
4. Установлено, что в генетической модели БАС происходят выраженные нарушения электрогенеза скелетной мышцы, заключающиеся в нарушении работы электрогенного Na+-K+ насоса и увеличении ионной проницаемости мембран скелетных мышечных волокон.
5.Полученные результаты проведенных методов качественной (иммуноблоттинг и иммунофлюоресцентный методы оценки наличия экспрессии белка) и количественной (определение уровня специфичных мРНК методом ПЦР-РВ) оценки экспрессии рекомбинантных генов факторов транскрипции свидетельствуют о наличии экспрессии Oct4, Klf4, cMyc, Sox2 в культуре клеток НЕК293Т и культуре эктомезенхимы зачатка зубов человека.
6.Показано существенное повышение экспрессии исследуемых генов при трансфецировании клеток плазмидными конструкциями, несущими гены факторов транскрипции fgf2, vegf, oct4, sox2, klf4, cmyc.
7.Трансфекция культуры клеток эктомезенхимы зачатка зуба человека плазмидой pBud-cMyc-Oct4 приводит к повышению уровня экспрессии гена Sox2. Полученные результаты свидетельствуют о наличии опосредованного влияния и взаимовлияния экспрессии генов Sox2 и Oct4. Таким образом, регуляция экспрессии генов факторов транскрипции может быть осуществлена непосредственно влиянием определенного гена в составе плазмидной ДНК и опосредованно через экспрессию гена той же группы.
Развернуть
3
01.07.2010 - 15.11.2010
В ходе выполнения 3 этапа НИР была исследована роль активных форм кислорода и мембранного холестерина в развитии нейродегенерации. Было установлено, что под действием бета-амилоидного пептида (БАП) – ключевого фактора патогенеза болезни Альцгеймера происходит повышение содержания активных форм кислорода (АФК) в препарате скелетной мышцы. Вместе с тем, в головном, спинном мозге и скелетной мышце трансгенных мышей с генетической моделью БАС на симптомной и досимптомной стадиях заболевания не наблюдается достоверных отличий в содержании одной из важнейших форм АФК – перекиси водорода, в сравнении с мышами дикого типа.
Развернуть
4
01.01.2011 - 05.09.2011
Электрофизиологически было установлено, что у APP+PSEN1 мышей наблюдается выраженное снижение базового квантового выброса нейромедиатора и изменения динамики амплитуды потенциалов концевой пластинки в процессе высокочастотной ритмической активности синапса (20 и 50 имп/с) в сравнении с мышами дикого типа. Методом флуоресцентной микроскопии с использованием маркера FM 1-43 было показано наличие процессов эндоцитоза синаптических везикул в двигательных нервных окончаниях APP+PSEN1 мышей, однако отмечалась часто встречающаяся «фрагментация» нервных терминалей на ярко светящиеся зоны, что может указывать на снижение площади нервного окончания, участвующей в процессах экзо-эндоцитоза. Оценка последующей «выгрузки» красителя и сопоставление с кумулятивными кривыми секреции нейромедиатора у APP+PSEN1 мышей показали выраженное угнетение процессов рециклирования синаптических везикул. Также было выявлено, что у APP+PSEN1 мышей наблюдается выраженное изменение процессов электрогенеза скелетных мышечных волокон, связанное с нарушением работы Na+-K+ ионного насоса и другими механизмами.
С помощью трансдукции факторами транскрипции Oct4, Sox2, cMyc и Klf4 были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека, а из них путем направленной дифференциации получены микроглия-подобные клетки, которые трансплантировали трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза (G93A мыши) и APP+PSEN1 мышам. Иммуногистохимический анализ показал, что трансплантированные клетки активно мигрируют в очаги нейродегенерации и сохраняют фенотип микроглия-подобных клеток. Помимо этого, проведена трансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, несущих двухкассетные плазмидные векторы pBud-VEGF-L1CAM, pBud-VEGF-EGFP и pBud-EGFP-L1САМ, G93A мышам. Через две недели после трансплантации данные клетки были обнаружены в спинном мозге мышей G93A; трансплантированные клетки экспрессировали маркёр эндотелиальных клеток — молекулу CD34, но не экспрессировали маркёры клеток макро- и микроглии ЦНС. Отработана методика моделирования ишемического инсульта и введения генетически модифицированных клеток на модели ишемического поражения головного мозга у крыс.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров
Продолжительность работ
2010 - 2012, 30 мес.
Бюджетные средства
3,5 млн
Организация
ИНЦ РАН
профинансировано
Тема
Доклинические исследования лекарственного средства пептидной природы на основе фактора дифференциации лейкоцитов для лечения нейродегенеративных и цереброваскулярных заболеваний.
Продолжительность работ
2012 - 2014, 24 мес.
Бюджетные средства
33 млн
Количество заявок
2
Тема
Разработка новых методов диагностики, профилактики и лечения широко распространенных, социально-значимых глазных заболеваний (катаракты и дегенеративных заболеваний сетчатки) на основе результатов фундаментальных исследований молекулярных механизмов зрительной рецепции в норме и патологии.
Продолжительность работ
2008, 3 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
2
Тема
Эндометриоз как медико-социальная проблема: патогенез, диагностика, лечение.
Продолжительность работ
2008, 3 мес.
Бюджетные средства
1,2 млн
Количество заявок
1
Тема
Исследование молекулярных процессов, лежащих в основе нейродегенеративных заболеваний.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
30 млн
Количество заявок
12
Тема
Создание методов генной и клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
18 млн
Количество заявок
5