Регистрация / Вход
Прислать материал

Разработка системы высокопроизводительного анализа генетических полиморфизмов для фундаментальных исследований закономерностей развития социально-значимых заболеваний человека

Информация отсутствует

Участники проекта

Зам. руководителя работ
Говорун Вадим Маркович

Этапы проекта

1
30.09.2009 - 31.12.2009
Наименование разрабатываемой продукции
- Промежуточный научный отчет с приложениями:
А. Инновационная образовательная программа по курсу: «Масс-спектрометрия в исследовании структуры нуклеиновых кислот».
Б. Научно-методические рекомендации «Методы пробоподготовки в генодиагностике».
В. Отчет по патентным исследованиям.

2. Характеристика выполненных на этапе работ по созданию продукции
2.1. В ходе модельных экспериментов с генами, включенными в стартовую панель осуществлена технологическая разработка всех лабораторных процессов этапа минисеквенирования: от пробоподготовки до хроматографической очистки продуктов реакции минисеквенирования. Отработаны реакционные условия, позволяющие с использованием универсального реакционного буфера последовательно осуществлять все предшествующие этапу минисеквенирования и последующие ему ферментативные реакции (ПЦР-амплификация ДНК, дефосфорилирование 5’-концевых фосфатных групп, хроматографическая очистка ДНК), что обеспечивает максимальную адаптацию к этапу МАЛДИ ВМС.
Для этапа пробоподготовки был использован модифицированный метод экспресс-выделения ДНК из клинических образцов. Адаптированный для работы с образцами периферической крови он позволяет в течение 20 минут получить препарат ДНК, не содержащий ингибиторов, препятствующих проведению полимеразной цепной реакции (ПЦР) и в количестве, достаточном для проведения нескольких сотен генетических тестов. Параллельно были поведены работы по оптимизации методов выделения ДНК из других видов биологических образцов по результатам которых были подготовлены методические рекомендации «Методы пробоподготовки в генодиагностике».
В ходе биоинформационного анализа рассмотрены результаты оригинальных исследований, опубликованных за период с 1993 по 2009 год в периодических научных изданиях молекулярно-генетического профиля и размещенные в виде реферативного материала в общедоступных базах данных. По результатам экспертной оценки источников данных была сформирована стартовая панель из 20 генов, представленных генами системы гемостаза, липидного обмена, ренин-ангиотензионового каскада, и генами детоксикации (цитохромы семейства P450 и глутатион-трансферазы).

2.2. Новизна решений, в данной работе состоит в том, что для использования в комбинации с масс-спектрометрическим измерением на платформе МАЛДИ ВМС удалось максимально оптимизировать весь каскад ферментативных реакций, включающий этапы пробоподготовки и финальной хроматографической очистки. Такая оптимизация позволила достичь адекватной производительности всей пре –масс-спектрометрической части разрабатываемого метода. Впервые применены универсальные буферные композиции, позволяющие все реакции проводить в одной пробирке, и реализован новый метод экспресс-выделения ДНК. В сочетании с последующим анализом продуктов реакции на времяпролетном МАЛДИ масс-спектрометре предлагаемая схема анализа в наибольшей степени соответствует решаемым задачам. С одной стороны реакция секвенирования, основанная на ферментативном достраивании нуклеотидной последовательности является фактически «золотым» стандартом в генетических исследованиях и обеспечивает наиболее высокую точность метода В то же время, масс-спектрометрический этап детекции будет обуславливать высокую производительность, низкую себестоимость, и возможность автоматизации измерения.
2.3. Работу отличает комплексный подход, направленный на решение нескольких параллельных задач. Так, работы по оптимизации этапа минисеквенирования изначально осуществлялись на группе клинически значимых генетических полиморфизмов, отобранных в ходе биоинформационного анализа для включения в панель молекулярно-генетических тестов на следующих этапах работы. Выработанные в ходе биоинформационного анализа критерии и алгоритмы обработки данных будут использоваться при формировании новых целевых панелей генетических маркеров. В ходе разработки усовершенствованного метода экспресс-выделения ДНК были оптимизированы и технологии получения препаратов геномной ДНК из других видов биологических образцов: (лейкоцитарная фракция периферической крови, буккальный соскоб, лиофилизированные образцы крови, кал). По результатам этой части работы подготовлены научно-методические рекомендации «Методы пробоподготовки в генодиагностике».
2.4. Объекты интеллектуальной собственности, созданные на отчетном этапе – не получено.

3. Области и масштабы использования полученных результатов
3.1. Не смотря на промежуточный характер полученных на данном этапе результатов по оптимизации блока лабораторных процедур, область их практического применения является обширной. Методы экспресс-пробоподготовки, данные по оптимизации реакционных условий минисеквенирования могут быть активно использованы как в научно-исследовательских центрах, так и в лабораториях практической направленности, осуществляющих исследования по генодиагностике. Выработанные критерии и алгоритмы обработки баз данных по генетическим исследованиям могут быть использованы для поиска и систематизации данных о генетических факторах, вовлеченных в патогенез широкого спектра заболеваний. Полученная в ходе биоинформационного анализа информация о медицински-значимых генетических вариациях представляет интерес для медицинских специалистов, проходящих обучение в рамках программ до- и последипломного образования.
3.2. Ход практического внедрения полученных результатов.
Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе в рамках Научно-образовательного центра физико-химической молекулярной и клеточной биологии при ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России: включены в лекционный материал, разбираются на практических занятиях. Для выполнения настоящей работы были привлечены аспиранты очной формы обучения «НИИ ФХМ» и студенты Московского физико-технического института (МФТИ), обучающиеся на кафедре «Молекулярная медицина» при факультете молекулярной и биологической физики. Результаты работ поэтапно докладывались на научно-практических семинарах и конференции молодых ученых.
3.3. Проведенное исследование позволило подготовить к защите одну диссертационную работу на соискание научной степени доктора биологических наук, создать задел для подготовки 2 диссертаций на соискание степени кандидата биологических наук, привлечь к работе двух аспирантов, тема диссертационных работ которых непосредственно связана с тематикой настоящего контракта. Таким образом, заданные индикаторы и показатели по первому этапу работ достигнуты.
4. Выводы
1. Работа выполнена с применением современных методических подходов и соответствует уровню мировых разработок по данной тематике.
2. В ходе работы на модельных экспериментах выполненных на стартовой панели генов были полностью отработаны и оптимизированы все основные этапы анализа, начиная от выделения ДНК из клинического образца до хроматографической очистки, предшествующей этапу масс-спектрометрического измерения.
3. Выработанные критерии и алгоритмы обработки баз данных по генетическим исследованиям могут быть использованы для поиска и систематизации данных о генетических факторах, вовлеченных в патогенез широкого спектра заболеваний.
4. Выполнение исследования позволило подготовить высококвалифицированные молодые научно-педагогические кадры и закрепить их в сфере науки и образования, а также внедрить полученные результаты в педагогический процесс.
Развернуть
2
01.01.2010 - 01.07.2010
- Технологическая разработка масс-спектрометрического
способа фракционирования продуктов реакции минисеквенирования при помощи технологии МАЛДИ ВМС.
- Разработка алгоритмов втоматизированной регистрации и интерпретация данных масс-спектрометрического секвенирования ДНК.
- Разработка мультиплексорного формата анализа нуклеотидного полиморфизма (от 3-х до 9-ти полиморфизмов в одной пробирке) за счет: увеличения кратности реакции ГЩР-амплификации целевых локусов ДНК
- увеличения кратности реакции минисеквенирования.
- Разработка научно-методических материалов для лекционного курса: «Высоко-производительные методы генетиче
ского анализа для исследования и диагностики мультифакториальных заболеваний человека»
- Адаптация основных лабораторных этапов протокола в
формат 96- и 384-луночных микропланшетов.
- Разработка лабораторного регламента «Анализ нуклеотидного полиморфизма ДНК методом масс-спектрометрического минисеквенирования»
Развернуть
3
02.07.2010 - 31.12.2010
- Биоинформационный анализ баз данных по нуклеотидному полиморфизму.
- Первичный отбор данных по наиболее значимым нуклеотидным полиморфизмам предрасположенности к сердечно-
сосудистым заболеваниям и их экспертная оценка.
- Разработка панели молекулярно-генетических тестов на основе разработанной технологии и адаптированных для использования в формате высокопроизводительного
МАЛДИ ВМС минисеквенирования.
- Анализ распространенности наиболее значимых генетических полиморфизмов предрасположенности к сердечно-
сосудистым заболеваниям в группе пациентов популяционного контроля московского региона.
- Разработка научно-методических материалов для научно-практического семинара для медицинских специалистов
разных специальностей по теме «Полиморфизм генов гемостаза и его практическое значение в современной медицине»
- Формирование банка образцов геномной ДНК пациентов группы популяционного контроля московского региона РФ.
- Подготовка научно-методических материалов для проведения конференции молодых ученых НИИ ФХМ с доклада-
ми по тематике исследований, проводимых в рамках НИР.
Развернуть
4
01.01.2011 - 01.07.2011
- Биоинформационный анализ и первичный отбор данных по наиболее значимым нуклеотидным полиморфизмам пред-
расположенности к онкологическим заболеваниям и их экспертная оценка.
- Адаптация технологии МАЛДИ ВМС минисеквенирования для анализа соматических мутаций — маркеров неопластического роста на модели колоректального рака.
- Адаптация технологии МАЛДИ ВМС минисеквенирования для количественного анализа метилирования ДНК в промоторных регионах генов- супрессоров неопластического роста на модели колоректального рака.
- Разработка панели молекулярно-генетических тестов основанных на комплексном анализе геномных полиморфизмов,соматических мутаций и метилирования для оценки риска
развития и ранней диагностики колоректального рака.
- Разработка научно-методических рекомендаций для нового курса практических занятий по теме «Методы масс-
спектрометрии в секвенировании de novo и анализе эпигенетических маркеров»
- Формирование банка клинических образцов пациентов с диагностированным колоректальным раком и пациентов
контрольных групп.
- Исследование по оценке вклада генетических (геномные и соматические мутации) и эпигенетических факторов (мети-
лирование ДНК) в патогенез колоректального рака
- Подготовка научно-методических материалов для методических рекомендаций по теме «Методы анализа метилирования ДНК в генодиагностике колоректального рака».
Развернуть
5
02.07.2011 - 15.09.2011
- Биоинформационный анализ и первичный отбор данных по нуклеотидным полиморфизмам генов системы детоксикации
организма (цитохромы Р450, глутатион-трансферазы), и генов метаболизма лекарственных препаратов.
- Разработка панели диагностических тестов для оценки эффективности терапии тромболитическими препаратами, основными препаратами химиотерапии рака, основными препаратами противовирусной терапии.
- Оценка влияния генетических факторов пациентов на особенность клинического течения заболевания при вирусном
гепатите В и С, и эффективности противовирусной терапии.
- Подготовка научно-методического материала для проведения научно-практического семинара по теме «Фармакогенетическое тестирование - первые шаги к персонифицирован-
ной медицине»
- Подготовка научно-методических рекомендаций по теме «Роль генетических факторов в предрасположенности к инфекционным заболеваниям и прогнозе эффективности противовирусной терапии»
- Исследование оценки эффективности подбора антикоагуляционной терапии с учетом генетического статуса пациента.
- Проведение патентных исследований, подача заявок на патенты
- Разработка программы внедрения результатов НИР в образовательный процесс.
Развернуть

Программа

Программа "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы

Программное мероприятие

1.1 Проведение научных исследований коллективами научно-образовательных центров
Продолжительность работ
2010 - 2012, 26 мес.
Бюджетные средства
2,1 млн
Организация
НИЯУ МИФИ
профинансировано
Тема
Разработка методов определения генетически обусловленной индивидуальной предрасположенности человека к социально значимым заболеваниям.
Продолжительность работ
2011 - 2012, 21 мес.
Бюджетные средства
30 млн
Количество заявок
8
Тема
Разработка эффективных способов доставки генетической информации в клетки-мишени in vivo для генотерапии социально значимых заболеваний.
Продолжительность работ
2009 - 2010, 17 мес.
Бюджетные средства
7 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка комплексных реабилитационных программ для наиболее распространенных социально значимых заболеваний человека (метаболический синдром, расстройства сна).
Продолжительность работ
2008 - 2009, 17 мес.
Бюджетные средства
7,8 млн
Количество заявок
4
Тема
Развитие и массовое применение новых технологий диагностики социально-значимых заболеваний на основе молекулярных методов многопараметрического анализа
Продолжительность работ
2005 - 2006, 23 мес.
Бюджетные средства
76 млн
Количество заявок
1
Тема
Разработка технологий и выпуск опытных партий синтетических и рекомбинантных белково-пептидных препаратов для коррекции патологических процессов и лечения социально значимых заболеваний
Продолжительность работ
2007 - 2008, 17 мес.
Бюджетные средства
100 млн
Количество заявок
3